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1、,课题3 血红蛋白的提取和分离,血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,Fe2+,一、基础知识:,1 、分离生物大分子的基本思路是什么？,本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2、蛋白质提取与分离的依据：不同种类蛋白质的物理化学性质不同：,蛋白质形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、对其他分子亲和力等千差万别。从而分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识-蛋白质提取和分离原理,3 、分离
2、不同的蛋白质方法：,2、原理：,1、材料-,实际上就是一些微小的多孔球体。小球内部有许多贯穿的通道. 大多数是由多糖类化合物构成，如葡聚糖、琼脂糖。,凝胶,(一)凝胶色谱法,（分配色谱法）：,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时， 相对分子质量较小的蛋白质：容易进入凝胶颗粒内部的通道，路程较长，移动速度较慢； 而相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶颗粒内部的通道，只能在凝胶外部间隙中移动，路程较短，移动速度较快。,3、具体过程：,一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理,一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理,大于凝胶颗粒孔隙 直径，被阻挡在颗 粒的外面
3、,小于凝胶颗粒孔 隙直径，可以进 入颗粒内部,垂直向下移动,垂直向下移动， 无规则扩散进 入颗粒内部,较快,较慢,较短,较长,先从凝胶柱洗脱 出来,后从凝胶柱洗脱 出来,1 、什么是缓冲液？,2、 缓冲液的作用是什么？,【思考2 】:,（二）、缓冲溶液-,在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠， NaH2PO4/Na2HPO4等,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,洗脱剂,3、 缓冲液是如何配制的？,4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？,
4、通常由12 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。,磷酸缓冲液,在本课题中使用的缓冲液是:_ ,其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性),2 .原理：,(三)电泳,1.电泳的概念,指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及 分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不
5、同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。,凝胶电泳原理示意图,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”， SDS所带负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。,(三)电泳,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,4 . SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离过程：,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,（1）样品处理：,包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集 到的血红蛋白溶液。,（2）粗分离：,透析除去分子较小的杂质。,（3）纯化：,通过凝胶色谱法
6、将分子量较大的杂质蛋白质除去。,（4）纯度鉴定：,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为实验材料？,（一）样品处理,血液的成分,（一）样品处理及粗分离,1、红细胞的洗涤：,（2）目的：去除杂蛋白。,血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层黄色血浆暗红色红细胞液5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色,（1）步骤：,柜式离心机,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,？,洗涤好的红细胞+蒸馏水+甲苯磁力搅拌器充分搅拌10min 红细胞破裂释放血红蛋白,2 、血红蛋白的释放：,蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是,
7、使红细胞大量吸水胀破,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,搅拌器转子,磁力搅拌器,搅拌器正在工作,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞 混合液,烧杯,红细胞破碎混合液转移离心管中中速长时离心（2000r/min10min）滤纸过滤除去脂质分液漏斗静置片刻分出下层的红色透明液体。,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,4、透析（粗提取）：,取1ML血红蛋白溶液装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析12小时。,透析袋：小分子自由通过，而大分子保留在袋内。,去除小分子的杂质,利用透析袋透析,
8、透析过程,（二）纯化凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,3.样品的加入和洗脱,（二）凝胶色谱操作,1、凝胶色谱柱的制作： 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 顶塞的制作：打孔安装玻璃管。 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。,如P68图5-19,注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的 凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋 白质分离不彻底。,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20m
9、mol/L磷酸缓冲液 装填:,2.凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间 的空隙。,3、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气 泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物 质的分离效果。,2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,装配好的凝胶柱如图5-21
10、,3.样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意：正确的加样操作：1、
11、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,3.样品的加入和洗脱,开始进行层析,收集得到的纯化后的蛋白,知识总结,血红蛋白的提取和分离,教学反馈,1凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度,B,B,3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌
12、球蛋白,B,A,5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠,C,D,7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物,C,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质,练习巩固,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,