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1、实验一 普通光学显微镜的使用及微生物形态观察一、实验目的1、学习并掌握油镜的原理和使用方法。2、学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。二、实验原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成（图2-1）。 1.镜座；2.载物台；3.镜臂；4.棱镜套；5.镜筒；6.接目镜；7.转换器；8.接物9.聚光器；10.虹彩光圈；11.光圈固定器；12.聚光器升降螺旋；13.反光镜；14.细调节器；15.粗调节器；16.标本夹机械装置由镜座、镜臂、镜筒与物镜转移器、载物台、移动器粗细调节器组成。光学系统由目镜、物镜、聚光镜、反
2、光镜、光圈组成。（1）目镜：装在镜筒的上端，一般各有8x、10x、15x、16x等种不同的放大倍数的目镜。目镜只能把物镜成的像再次放大，没有辨析能力。（2）物镜：显微镜的物镜是由一组特殊的透镜组成。一般有低倍镜（ 10x ）、高倍镜（ 40x ）和油镜（ 100x ），它们各有一定的放大率，不仅可以放大标本，而且有辨析能力。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要又有如下两方面的原因：1、增加照明亮度 油镜的放大倍
3、数可达100 ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时需在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率（n =1.55）相仿的镜油（通常使用香柏油，其折射率n =1.52）。2、增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力（resolution or resolving power）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象
4、及所用物镜性能的限制，可表示为：式中：=光波波长，NA=物镜的数值孔径值。三、实验器材1、菌种 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和四联球菌染色玻片标本。2、溶液或试剂 香柏油、1:3酒精乙醚混合液。3、仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸。四、实验步骤1、观察前的准备（1）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约34。镜检时姿势要端正。 取、放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。（2）光源调节 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的
5、照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。2、显微观察 将标准片置于载物台，在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵从由低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。（1）低倍镜观察 （2）高倍镜
6、观察 （3）油镜观察 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在油镜中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能由于油镜头下降还没有到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降
7、镜头时用力过猛，或聚焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。3、显微镜用毕后的处理（1）上升镜筒，取下标准片。（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许无水乙醇擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的无水乙醇。切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用稠布清洁显微镜的金属部件。（4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“ 八 ”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验结果 分别绘出你在油镜下观察到的微生物的形态。六、思考题用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之
8、间加滴什么油？起什么作用？实验二 细菌的革兰氏染色 一、实验目标 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理 用革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G一表示。革兰氏染色原理：结晶紫使菌体着上紫色，碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。G
9、菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，番红复染后呈红色。 三、实验器材 （1）菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 (2)试剂：生理盐水、草酸铵结晶紫紫、路哥氏碘液、95%乙醇、沙黄或番红复染液。 (3)其他器材：显微镜、载玻片、J酒精灯、吸水纸、接种环、镜头纸等。四、操作步骤 1.涂片 无菌操作蘸取少量的新培养的枯草芽孢杆菌)和培养的大肠杆菌分别制作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，也可在同一载玻片上，用玻璃铅笔划线，分为两个区域而分别制作涂片。 2.干燥、固定 干燥固定时通过火焰，不可过热，以玻
10、片不烫手为宜。 3.染色 (1)初染：加草酸氨结晶紫一滴，染色约1min，水洗。 (2)媒染：滴加碘液，并覆盖约1min，水洗。(3)脱色：将载玻片上面的水吸净，并衬以滤纸为白色背景，用95%酒精，脱色约2-30S，此步骤为关键一步，必须严格掌握时间，到时立即用水冲载玻片背面。 (4)复染：用番红染液复染1-2min，水洗。 4.干燥 同实验二。 5.镜检 干燥后，用油镜观察，革兰氏阴菌呈红色，革兰氏阳性菌呈深紫色，以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常呈假阳性。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌:而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行分解了，都常呈阴性反应。五、实验报告 报告结果并绘图。六、思考题(1)在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色?它们是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌?(2)制作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚?其染色成败的关键一步是什么? (3)对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确定你的染色技术操作正确结果可靠?