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1、第 18 卷第 2 期湖 北 职 业 技 术 学 院 学 报NO 2 VOL 182015 年 6 月JOUNAL OF HUBEI POLYTECHNIC INSTITUTEJUN 2015文章编号16718178( 2015) 02010703柯萨奇病毒 A10 型 VP1 蛋白的线性 B 细胞表位预测沈红元1 ，陈玉蓉2( 1 湖北职业技术学院 医学院，湖北 孝感 432000; 2 湖北汉川血防医院 检验科，湖北 汉川 431600)摘要 目的: 预测柯萨奇病毒 A 组 10 型( CVA10) 的 VP1 蛋白的线性 B 细胞抗原表位，为 CVA10 疫苗研制提供理论基础。方法: 分
2、析我国近年流行的 CVA10 分离株的 VP1 序列进化特征; 选择代表株以 DNAStar 软件预测其 VP1 蛋白序列的二级结构、亲水性、柔韧性、表面可能性和抗原指数等指标，根据这些指标综合分析预测 VP1 蛋白中可能的 B 细胞表位区域。结果: 相对于 CVA10 原型株，我国 CVA10 分离株的 VP1 序列已发生了较大的变化; CVA10 代表株的 VP1 中存在较多的 转角，而无规则卷曲结构较少;根据 VP1 序列的理化性质和二级结构等多种特征，预测到 9 个可能的线性 B 细胞表位。结论: 成功预测到我国 CVA10 分离株 VP1 可能的 B 细胞表位区域，为 CVA10 表
3、位疫苗的研发提供了理论基础。关键词 手足口病; 柯萨奇病毒; B 细胞表位中图分类号373 2 + 3文献标识码ADOI:10.16347/42-1742/z.2015.02.024手足口病( Hand，foot and mouth disease，HFMD)是多种肠道病毒( Enterovirus，EV) 引起的一种儿童常见传染病，其主要病原是 EV71 型和柯萨奇病毒( Coxsackievirus，CV) A161 2近年来，柯萨奇病型。毒( Coxsackievirus，CV) A10 型引起的手足口病感染1，3CVA10 属于小 NA 病毒科，有逐渐升高趋势。肠道病毒属 A 组成员，
4、VP1 蛋白是 EV 衣壳蛋白表层部分，是 EV 主要中和表位所在区域，直接影响病4毒的抗原性。 本研究旨在通过生物信息学方法预测 CVA10 VP1 蛋白中的线性 B 细胞表位，为 CVA10疫苗和病原诊断试剂的研发提供理论依据。1 材料与方法1 1 CVA10 全长 VP1 序列的获取和进化分析从 NCBI 的 protein 数据库 ( http: / /www ncbinlm nih gov /protein / ) 中检索并下载 CVA10 的 VP1全长氨基酸序列，选择我国近年的 CVA10 分离株与 CVA10 的原型株 ( Kowalik 株) 一起进行分析。用 DNAStar
5、 软件的 MegAlign 程序进行序列一致性分析，用 ClustalX 软件进行多序列 比 对，然 后 用MEGA4 0 软件的邻接法 ( Neighbor joining meth-od，NJ) 构建进化树，建树的可靠性经过自展法检验( Bootstrap 1000 次重复) 。1 2CVA10 VP1 蛋白二级结构预测分别采用 DNAStar 软件 Protean 模块中的 Chou Fasman 和 Garnier obson 两种方法来预测CVA10 VP1 蛋白的二级结构。1 3CVA10 VP1 蛋白线性 B 细胞表位预测利用 DNAStar 软件 Protean 模块中 Kyt
6、e Doolit-tle 方法预测 CVA10 VP1 蛋白的亲水性，Emini 方法预测其表面可能性，Karplus Schulz 方法预测其柔韧性，Jameson Wolf 方法预测其抗原指数。综合收稿日期2015 03 19作者简介 沈红元( 1974 ) ，女，湖北荆门人，湖北职业技术学院医学院讲师，主管技师，主要研究实验医学。基金项目本文系湖北职业技术学院 2014 年度校级课题“柯萨奇病毒 A10 型 VPI 蛋白的线性 B 细胞表位预测”( 项目编号:2014B06) 的阶段性研究成果。107沈红元，陈玉蓉: 柯萨奇病毒 A10 型 VP1 蛋白的线性 B 细胞表位预测VP1 蛋
7、白的这些性质和其二级结构特征，预测出较多的 转角，而无规则卷曲结构较少， 螺旋区很VP1 蛋白中最可能的线性 B 细胞表位区域。少。( 见图 3)2结果2 1CVA10 VP1 序列的进化分析结果将自我国感染病例分离获得的 CVA10 毒株( AHF49571 1，河北 2010; BAQ00363 1，云南 2014) 与 Kowalik 株进行 VP1 序列一致性分析发现，相对原型株，我国分离株的 VP1 序列已经发生了较大的变化，而我国两分离株间 VP1 序列分歧相对较小。( 见图 1) 根据各分离株全长 VP1 氨基酸序列构建的系统进化树显示，我国 CVA10 分离株与原型株位于不同的
8、进化分支上，而我国两分离株聚成一簇，显示较近的亲缘关系。( 见图 2) 因此，本文选择我国新近分离的 CVA10 毒株的 VP1 蛋白序列( BAQ00363. 1) 作为代表进行以下 B 细胞表位的预测。图1 CVA10 代表株的 VP1 核苷酸和氨基酸序列一致性分析 A: 核苷酸序列一致性分析; B: 氨基酸序列一致性分析; Perent Identity，一致性百分比; Divergence，进化分歧; CVA10，柯萨奇病毒 A10 型; CVA10 Kowalik，CVA10的原型株。图 3 CVA10 VP1 蛋白的二级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可能性预测结果2 3CVA
9、10 代表株 VP1 蛋白中线性 B 细胞表位预测结果根据 DNAStar 软件 Protean 模块对 VP1 蛋白的亲水性、柔韧性、抗原性指数和表面可能性的预测结果，( 见图 3) 选取亲水性高( 指数0) 、柔韧性好、可及性大( 指数1) 和抗原性强( 指数0) 的区域，同时参考 VP1 蛋白二级结构的预测结果，选取包含无规卷曲和 / 或 转角区域，获得共 9 个可能的线性 B 细胞抗原表位区域( 10 22 个氨基酸) ，其位置及氨基酸组成见表 1。表 1CVA10 VP1 蛋白可能的 B 细胞线性抗原表位B 细胞抗原表位区域氨基酸组成10 20DALGNTAAI30 45ANTTPS
10、SHLETGVP50 66AETGATSNATDENMIET96 105TDGGTDTTGY138 150TTTKNGEAPYML157 168PGAPKPTGDAF205 220DGYPTFGQHPETSNTT261 272VPPISQPYLL275 296FPNYDSSKVTNSADSSIKQA图2 基于 CVA10 分离株的全长 VP1 氨基酸序列构建的系统进化树CVA10，柯萨奇病毒 A10 型; CVA10 Kowalik，CVA10 的原型株; CVA16 的临床分离株 AJG01269 1 作为组外株。2 2CVA10 代表株 VP1 蛋白的二级结构预测结果结合 Gamier o
11、bson 方法和 Chou Fasman 方法预测发现: CAV10 VP1 蛋白中存在丰富的 折叠，1083讨论自我国将手足口病列为法定传染病并实施监测2由于其以来，我国每年都有手足口病的暴发流行。病原众多，且 EV 易于变异，因此难以得到有效的防控，只有研制出特异性疫苗才是控制其流行的最佳5除了 EV716以外，针对其他措施。疫苗进入临床5本文对手足口病手足口病病原的疫苗研究很少。重要病原 CVA10 的主要衣壳蛋白 VP1 进行中和表位的预测，将有助于手足口病疫苗进一步的研究。由于频繁的重组和选择压力，EV 相对其他 NA第 18 卷第 2 期湖 北 职 业 技 术 学 院 学 报NO
12、2 VOL 182015 年 6 月JOUNAL OF HUBEI POLYTECHNIC INSTITUTEJUN 20157病毒有着更快的进化速率。 本文对 CVA10 VP1 的进化分析发现，我国近年的分离株与原型株的 VP1 的核苷酸序列一致性仅约 76% ，( 见图 1A) 已接近进8化为新的 EV 型别， 而我国近几年的分离株之间的差异尚小。因此我们选择近期 ( 2014 ) 分离株( BAQ00363 1) 为代表进行了表位的预测。抗原表位筛选方法有晶体衍射法、重叠肽法、芯片扫描法和生物信息学预测等; 随着生物信息技术的快速发展，利用生物信息学软件或在线服务器预测抗原表位已成为抗
13、原表位研究的重要工具，它可9李月以大大减少工作量，加快了疫苗的研制速度。10利用生物软件成功预测到 EV71 的多个中和香等表位。利用 DNAStar 软件的 Protean 模块，可同时获得蛋白质的多种理化性质和结构特征，成为抗原表11位预测的常用工具。 本研究利用该工具预测到 CVA10 VP1 中 9 个可能的线性中和表位，其中部分12 13表位与已证实的其他 EV 表位区域部分重合，下一步我们将实验验证这些预测表位的正确性。参考文献1 Tian H，Zhang Y，Sun Q，et al Prevalence of multiple en-teroviruses associated
14、with hand，foot，and mouth disease in Shijiazhuang City， Hebei province， China: outbreaks of coxsackieviruses a10 and b3J PLoS One，2014，9 ( 1 ) : e842332于德山，张勇，陈建华 甘肃省 2008 2012 年手足口病流行特征及病原学研究J 病毒学报，2014，30( 1) : 26 323 Lu Q B，Zhang X A，Wo Y，et al Circulation of coxsack-ievirus a10 and a6 in hand foo
15、t mouth disease in china， 2009 2011J PLoS One，2012，7( 12) : e520734甄若楠，张颖，谢华萍，等 2010 2012 年广州市柯萨奇病毒 A4、A10 型 VP1 基因特征分析J 中华预防医学杂志，2014，48( 6) : 445 4505 Yip C C，Lau S K，Woo P C，Yuen K Y Human enterovir-us 71 epidemics: whats next? J Emerging health threats journal，2013，6: 197806 Zhu F C，Meng F Y，Li
16、J X，et al Efficacy，safety，and im-munology of an inactivated alum adjuvant enterovirus 71 vaccine in children in China: a multicentre，randomised， double blind，placebo controlled，phase 3 trialJLancet，2013，381( 9882) : 2024 20327 He Y Q，Chen L，Xu W B，et al Emergence，circulation， and spatiotemporal phyl
17、ogenetic analysis of coxsackievirus a6 and coxsackievirus a10 associated hand，foot，and mouth disease infections from 2008 to 2012 in shenzhen，chinaJ J Clin Microbiol，2013，51( 11) : 3560 35668 Oberste M S，Maher K，Kilpatrick D ，Pallansch M A Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation
18、of serotype with VP1 sequence and application to picornavir-us classificationJ J Virol，1999，73( 3) : 1941 19489欧阳玉梅 构象性 B 细胞表位预测的免疫信息学方法及其网络资源J 生命科学，2010，22( 9) : 946 95110李月香 肠道病毒 71 型串联表位疫苗的分子设计与免疫效果评价D 合肥: 安徽医科大学，201411刘雪婷 H7N9 流感病毒 HA、NA 蛋白的抗原表位预测及其与 HLA 类等位基因的相关性分析J 中国免疫学杂志，2015，31( 1) : 16 211
19、2俞海洋，王明丽 肠道病毒 71 型六安地区分离株 VP1 基因的生物信息学分析及 B 细胞表位预测J 安徽医科大学学报，2012，47( 3) : 233 24013王锦，许国章，倪红霞 肠道病毒 71 型 VP1 蛋白二级结构及 B 细胞表位的预测J 中国人兽共患病学报，2011，27( 10) : 905 908( 责任编辑: 胡国平)( 下转第 95 页)109梁遗鹏: 学前教育专业“三笔字”教学的思考写姿势，努力地提高他们的书写技能，他们就必将成2蓝树宽 中小学生硬笔执笔方法不当之分析J 中国钢为民族复兴伟大工程中的宣传队和播种机。笔书法，2000( 4) 453李作泉 指导书法教学
20、的途径与方法J 青少年书法，参考文献2001( 1) : 71章樟生 写字教学中兴趣的培养J 中国钢笔书法，( 责任编辑: 方楚勤)2000，( 6) : 44 45eflection on Three Kindsof Handwriting Teaching for Pre School Education MajorLIANG Yi peng( School of Arts Media，HuBei Polytechnic Institute，Xiaogan，Hubei 432000，China)Abstract: Due to the popularization of computers
21、 in the era of picture reading，the practical function of cal-ligraphy is gradually stepping down from the stage of history，and the artistry of handwriting is marginalized as well The application of three kind of handwriting ( characters written with a chalk，a pen and a writing brush) involves in the
22、 whole career of pre school education majors who will be educators for children in future Since the higher realistic significance in practicability，artistry and the multiple educational functions，it is essential to attach impor-tance to cultivating students interest in calligraphy，enhancing their wr
23、iting EQ，standardizing writing factors，rein-forcing writing foundation，strengthening practice，appreciating masterpieces，and improving students accomplish-ment to solve problems in three kinds of handwriting teaching for pre school majorKey words: pre school education; calligraphy; three kinds of han
24、dwriting; teaching( 上接第 109 页)Predication of Linear B Cell Epitope of Coxsackie A10 Virus Coat Protein VP1SHEN Hong yuan1 ，CHEN Yu rong2( 1 Medical School，Hubei Polytechnic Institute，Xiaogan，Hubei 432000，China;2 Laboratory Department，Hanchuan Schistosomiasis Control Hospital，Xiaogan，Hubei 432000，Chi
25、na)Abstract: Objective: To predicate the linear B cell antigen epitope of Coxsackie A10 ( CVA10) virus coat protein VP1 and establish the theoretical basis for CVA10 Vaccine manufacture Methods: In order to analyze and predicate the possible B cell epitope area of coat protein VP1，the author uses me
26、thods as follows: analyze evolu-tion features of VP1 series of CVA10 isolates which are popular in China recently and use DNAStar software to fore-cast indexes of representative strains，including sub structure，hydrophilicity，pliability，surface probability and antigen indexes etc esults: Compared wit
27、h CVA10 prototypes，VP1 series of CVA10 isolates in China have changed a lot There exist angles in VP1 series of CVA10 samples，with few irregular curly structures Based on the physical chemical properties and substructure of VP1 series，9 possible linear B cell epitopes are predica-ted Conclusion: The successful predication of the possible B cell epitope of CVA10 isolates in China provides a foundation in theory for CVA10 Vaccine research and productionKey words: HFMD; Coxsackie Virus; B cell Epitope95