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1、-范文最新推荐- 耐热谷氨酸脱氢酶的提取 摘要：谷氨酸脱氢酶是一种依赖NAD(P)的脱氢酶，它可逆地催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氮。该酶广泛存在于动物、植物和微生物，在氮代谢中具有重要作用。可以通过筛取耐高温菌从而提取菌落中的耐高温谷氨酸脱氢酶。 广泛的收集微生物，并在高温下培养，从而得到耐高温菌。对耐热菌进行细胞破碎，得到菌体中的酶。通过分析其能否分解谷氨酸来判断是否含有耐热谷氨酸脱氢酶。然后再通过分离纯化得到耐热谷氨酸脱氢酶。11762关键词：耐热;谷氨酸脱氢酶;NAD;提取毕业设计说明书（论文）外文摘要TitleExtraction of the heat of glut
2、amate dehydrogenaseAbstractGDH is dependent on NAD(P), It reversibly catalyzed by glutamate deamination to generate α- Ketoglutarate and nitrogen. GDH is widely present in animals, plants and microorganisms which plays an important role in nitrogen metabolism. Screen to take the high-temperatu
3、re bacteria, and then extract the thermostable glutamate dehydrogenase in the colony.Extensive collection of microorganisms, and cultured at high temperatures, resulting in a high-temperature bacteria. Get the enzyme in the bacterial, by disrupting high- temperature bacteria cell. By analyzing its a
4、bility to decompose the glutamate to determine whether it contains the heat of glutamate dehydrogenase. Then get the heat glutamate dehydrogenase through separation and purification.KeywordsHeatglutamate dehydrogenaseNADExtract 目次1引言11.1谷氨酸脱氢酶简介11.2耐热谷氨酸脱氢酶的结构性质11.2.1耐热谷氨酸脱氢酶的分子结构11.2.2耐热谷氨酸脱氢酶的最适温度
5、11.2.3耐热谷氨酸脱氢酶的热稳定性21.2.4耐热谷氨酸脱氢酶的最适PH2 1.2耐热谷氨酸脱氢酶的结构性质1.2.1耐热谷氨酸脱氢酶的分子结构谷氨酸脱氢酶是一种变构酶，由6个相同的亚基聚合而成，每个亚基的分子量为56000。生化特性和三维结构的同源酶在嗜热和嗜温细菌的数量增加的研究比较中发现了大量的分子为适应各种可能提升的内在稳定作出了贡献。从不耐热的氨基酸残基中提取出稳定的结构，改进氢键模式和疏水填料，降低表面积和体积比，来增加离子对数量和网络存在的大型离子。蛋白质工程方法已经被应用，一方面为了测试这一适应机制的有效性，另一方面改变新生成酶的属性，还有就是野生型和工程酶的生化和结构特点
6、4。1.2.2耐热谷氨酸脱氢酶的最适温度谷氨酸脱氢酶作用的最适温度为40，在高于或低于这个温度时，谷氨酸脱氢酶的活力都较低。而耐热谷氨酸脱氢酶的最适温度则可以很高，甚至超过1005。1.2.3耐热谷氨酸脱氢酶的热稳定性（1）4贮存的稳定性：将GDH液在4冰箱贮存10天，其活力几乎没有变化。（2）37贮存的稳定性：将GDH在37水浴中保温，在开始的20分钟内，其活力降低较快，其后活力下降速度明显减慢6。1.2.4耐热谷氨酸脱氢酶的最适PH谷氨酸脱氢酶活力受pH影响很大，经研究其作用时最适pH为8.57。1.2.5离子对强度对GDH活性的影响离子强度对谷氨酸脱氢酶的影响很大，因为过高或过低的离子强
7、度会影响谷氨酸脱氢酶的带电状态，谷氨酸脱氢酶的最适离子强度是0.25mol/L磷酸盐缓冲液6。1.3耐热谷氨酸脱氢酶的研究现状1.3.1谷氨酸脱氢酶在生产谷氨酸上的应用谷氨酸脱氢酶( GDH) 是谷氨酸生物合成的关键酶, 谷氨酸棒杆菌S9114是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种, 其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶, 研究其辅酶组成, 对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质, 提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、EDTA的TrisHCl 缓冲液( pH 7.5) 洗涤, 用French pressure cell press 破碎
8、, 离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用AKTA_100 快速纯化系统DEAE_纤维素柱、疏水柱( HIC) 、G_200 凝胶过滤柱层析得到纯化大约70 倍的以NADPH为辅酶的GDH 和部分纯化的以NADH 辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH 高度专一, 不能相互代替。经HPLC 和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为188kD和32kD,表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHI U_3000 分光光度计利用NAD(P)H在340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford方法进行, 并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表
9、明S9114中确实存在两种GDH,其中以NADH 为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样, S9114可能也以NADPH 为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢, 以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。同时发现以NADPH为辅酶的GDH在280nm吸收很弱, 在215nm吸收很强。说明此酶中酪氨酸、苯丙氨酸含量较低8。 1.3.3谷氨酸脱氢酶提取的原材料目前的文献报道中，谷氨酸脱氢酶都是从动物的肝脏中或者从谷氨酸棒状杆菌中提取的。这是由于在肝脏中，其谷氨酸脱氢酶的含量最高，所以最容易提取。在谷氨酸棒状杆菌中，谷氨酸脱氢酶是必不可少的酶，同时也是含量最高的最主要的酶，所以
10、可以提取到纯度较大的酶，便于分析和研究其性质。1.3.4耐热谷氨酸脱氢酶的研究目前，还没有文献报道是关于耐热谷氨酸脱氢酶的研究。所以文献的研究都限制于常温下的GDH。主要内容都是在最适温度40下，其酶活、性质以及其分子结构最适PH等的研究。而耐热谷氨酸脱氢酶指的是在高温下（65）其酶活力和性质的研究。1.4本研究的内容1.4.1耐热谷氨酸脱氢酶的提取谷氨酸脱氢酶广泛的存在于动植物和微生物中，因此耐热谷氨酸脱氢酶也广泛的存在于耐热的细菌或者古菌中。本研究只要筛取到耐热的菌种，然后再通过发酵，得到大量的菌体，从而可以从菌体中提取到耐热谷氨酸脱氢酶。（1）耐热菌的筛取：广泛的寻找土样和水样，然后在6
11、5恒温振荡器中富集培养，培养10小时左右后，取出培养液，在培养皿中划线，再放在恒温箱中培养10小时左右。如果培养皿中有菌落，则此菌落为耐热菌。不断重复，寻找大量耐热菌。（2）耐热谷氨酸脱氢酶的提取：将筛取的耐热菌体进行发酵，得到大量菌体后进行细胞破碎，然后再从破碎液中分离提取到耐热谷氨酸脱氢酶。并检测酶活。1.4.2谷氨酸脱氢酶的分离纯化方法本实验中谷氨酸脱氢酶的分离纯化遵从酶蛋白提取的一般原则：首先选取新鲜且目的蛋白含量高的组织为材料，将其破碎后，选择合适的抽提液，通过离子强度、pH、溶解度等的调节将蛋白质与其他细胞组分分开。通过等电点、盐析、有机溶剂等沉淀的方法分离目的蛋白与杂蛋白。再根据目的蛋白的酸碱性质、电荷情况、等电点、分子量的大小、形状、溶解度、稳定性、吸附性质等特性纯化目的蛋白。根据谷氨酸脱氢酶的溶解特性、带电性质和分子大小，结合酸沉淀、盐析、SEAE离子交换柱层析、分子筛等技术分离纯化谷氨酸脱氢酶。 耐热谷氨酸脱氢酶的提取(4): 9 / 9