WISP_2siRNA对人脑胶质瘤U251细胞增殖_凋亡的影响_唐智.docx

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1、国际神经病学神经外科学杂志2013 年第 40 卷第 3 期论著WISP-2 siNA 对人脑胶质瘤 U251 细胞增殖、凋亡的影响唐智1* ，袁 瑞2 ，何正文11 湖南省 瘤医院神 外科( 即中南大学湘雅医学院附属 瘤医院) ，湖南 沙410013;2 中南大学湘雅医院神 外科，湖南省 底外科与神 瘤研究中心，湖南 沙410008摘 要: 目的 探讨 siNA 沉默 WISP-2 基因表达对人脑胶质瘤细胞 U251 增殖 、凋亡的影响 。方法 脂质体介导 siNA转染人脑胶质瘤细胞 U251 后，检测 U251 细胞的增殖 、凋亡的变化，并用 Western blot 法检测 WISP-2

2、 、Bcl-2 、Bax 蛋白的表达 。结果 WISP-2 siNA 能有效抑制 U251 细胞株的生长，诱导凋亡，siNA 干扰组 WISP-2 蛋白表达水平为 ( 18 67 1 40 ) % ，明显低于空白对照组 ( 70 18 1 82 ) % 和阴性对照组 ( 69 41 1 77 ) % ，且差异有统计学意义 ( P 0 01 ) ; siNA 干扰组 Bcl-2 、Bax 蛋白表达水平为 ( 29 67 1 47 ) % 、( 31 62 1 32 ) % ，明显低于空白对照组和阴性对照组，且差异有统计学意义 ( P 0 01 ) 。结论 WISP-2 siNA 抑制 WISP-

3、2 mNA 和蛋白表达后，能有效抑制胶质瘤细胞的增殖，增加 U251 细胞凋亡，可能通过下调 Bcl-2 / Bax 蛋白表达的比值来诱导细胞凋亡 。关键词 : 胶质瘤; WISP-2 ; 增殖; 凋亡 ; Bcl-2 / BaxEffects of WISP-2 siNA on proliferation and apoptosis of human glioma U251 cellsTANG Zhi1 ，YUAN Xian-rui2 ，HE Zheng-wen1 ，1 Neurosurgery Department of Hunan Provincial Tumor Hospital (

4、The Affiliated Tumor Hospital of Xiangya Medical School of Central South University) ，Changsha，Hunan 410013; 2 Neurosurgery Department of Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008Abstract: ObjectiveTo investigate the effects of siNA-mediated WISP-2 gene silencing on the prolife

5、ration and apoptosis of humanglioma cell line U251 MethodsLiposome-mediated transfection with WISP-2 siNA was performed in human glioma U251 cells Theeffects of WISP-2 suppression on the proliferation and apoptosis of U251 cells were evaluated by MTT assay and flow cytometry Theprotein expression of

6、 WISP-2，Bcl-2，and Bax after the gene silencing of WISP-2 in U251 cells was measured by Western blotesultsThe MTT assay showed that the cell growth rate was significantly lower in siNA interference group than in blank controlgroup and negative control group ( P 0 05) The flow cytometry showed that th

7、e mean apoptotic rate of siNA interference group was16 59 1 40% ，significantly lower than those of blank control group ( 3 13 0 34% ) and negative control group ( 3 42 0 48% )( P 0 01) WISP-2 siNA significantly inhibited the growth and induced the apoptosis of U251 cells WISP-2 protein expression wa

8、ssignificantly lower in siNA interference group ( 18 67 1 40% ) than in blank control group ( 70 18 1 82% ) and negative controlgroup ( 69 41 1 77% ) ( P 0 01) The protein expression of Bcl-2 and Bax was significantly lower in siNA interference group( 29 67 1 47% and 31 62 1 32% ) than in blank cont

9、rol group and negative control group ( P 0 01) ConclusionsWISP-2siNA，which inhibits the mNA and protein expression of WISP-2，can effectively suppress the proliferation and promote the apopto-sis of U251 cellsAnd the cell apoptosis may be induced by down-regulating the Bcl-2 /Bax ratioKey words: glio

10、ma; WISP-2; proliferation; apoptosis; Bcl-2 /BaxWISP -2 属于即刻早期基因高半胱氨酸蛋白12一，在多 种 肿 瘤 组 织 中 高 表 达。研 究 显 示61 / 结缔组织生长因子 / 肾母细胞瘤过度表达基因WISP -2 在正常脑组织中无表达，但在胶质瘤中的( cysteine rich61 / connective tissue growth factor /表达升高，且在高病理级别的胶质瘤组织中的表达nephroblastomaoverexpressed gene ，CCN ) 家族成员之高于其在低病理级别的胶质瘤中的表达，WISP -

11、2收稿日期: 2013 02 28; 修回日期: 2013 05 03作者简介: 唐智( 1982 ) ，博士，主治医师，主要从事神经肿瘤的临床与基础研究。199Journal of International Neurology and Neurosurgery2013 ，40 ( 3 )可能在胶质瘤的生物学行为中起一定作用。本研究用 WISP -2 siNA 转染人胶质瘤细胞 U251 细胞株，以研究 WISP -2 基因沉默后对人胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响。1 材料与方法1 1 材料与试剂人 脑胶质瘤细胞株 U251 ( 中南大学湘雅中心实 验室细胞库 ) ，WISP -2 、GDPDH

12、 引物 ( 北京博迈得公 司 ) ，T -PC 试 剂 盒 ( TaKaa 公 司 ) ， Lipo-fectamine TM 2000 、NA Trizolrose ( intrivogen 公司 ) ，兔抗人单克隆抗体 WISP -2 、GDPDH ( Abcam 公司 ) ，兔抗人单克隆抗体 Bcl -2 、Bax ( 北京博奥森公司 ) ，S -P 试剂盒 、DAB 试剂盒 ( 北京中山公司 ) 。1 2方法1 2 1 细胞培养 用含 l0 % 灭活胎牛血清的PMll 640 、1 105 U / L 青霉素和 100 mg / L 链霉素作为培养基，将 U251 胶质瘤细胞置于含 5

13、 % C02 、37 细胞培养箱内培养，每 2 3 天传代 1 次。取对数生长期的细胞用于实验。1 2 2 WISP siNA 的合成与转染 从化学合成的 3 条 WISP -2 -siNA 序列中筛选出 1 条最有效的siNA 序 列 WISP -2 -siNA -289 ，正 义 链 : 5 -GA-CAGCAGCUGUGAGGUGATT -3 ，反 义 链 : 5 -UCAC-CUCACAGCUGCUGUCTT -3 。 用 Free -Nase 水 将 干粉 siNA 稀释成浓度为 20 nmol / L 。转染前 24 h ，取对数生长期的细胞用胰酶消化 、计数，按 Lipo-fec

14、tamine 2000 说明书进行转染，然后加入新鲜培养基，继续培养。1 2 3MTT 法检测细胞增殖 将对数生长期的U251细胞分为 3 个组，空白对照组 : 未予任何干扰的 U251 细 胞 株 ; 阴 性 对 照 组 : 加 入 非 特 异 性siNA / Lipofectamine 复合物的 U251细胞株 ; siNA干扰实验组 : 为 WISP -2 -siNA -289脂质体转染的U251细胞株 。收集对数期 U251 细胞，调整细胞悬液浓度，接种于 96 孔，每孔 200 l ，含细胞数约1 104 个 / 孔，置 37 、5 % CO2 温箱培养 。各实验组 分别于培养后 2

15、4 h、48 h、72 h、96 h、5 d 用于 MTT检测 ; ( 二 甲 基 亚 砜 ) ，在 酶 标 仪 上 测 定 各 孔，492 nm 波长处 OD 值，以空白细胞组作为对照组 。以培养时间为横轴，OD 值为纵坐标，在 SPSS 13 0软件中绘制生长曲线。1 2 4 Western blot 法检测 WISP -2 、Bcl -2 、Bax 蛋白的表达 分组同上 。转染 48 H 后，以含 0 25 % 胰蛋白酶消化收集细胞，用终浓度为 1 mmol / L 蛋白裂解液 IPA 裂解细胞，在 4 ，12000 r / min ，离心 15 分钟，取上清，测蛋白浓度后，每个样品蛋白

16、终浓度均调整为 2 g / l ， 80 保存备用 。将定量后的蛋白质 100 加热 5 分钟后上样电泳，经15 % SDS -PAGE 电泳后转 PVDF 膜 90 min ，用 1 ml 1 4000 稀释的 I 抗 4 封闭过夜，弃 I 抗后加入1 ml 辣根过氧化物酶标记二抗 ( 1 5000 稀释 ) ，室温温育 2 h 后漂洗，发光液显影，成像 。以 GDPDH 检测作为内对照。1 2 5流式细胞术( FCM ) 检测细胞凋亡 分组同上 。各处理组在转染 48 h 后以 0 25 % 胰酶消化，制成单细胞悬液 ( 1 106 / ml ) ，1000 g 离心 5 分钟，PBS 洗

17、涤细胞 3 次，用 4 预冷的 70 % 乙醇固定 ( 4 保存 ) ，固定不少于 12 小时 。1000 g 离心去除乙醇 。调整细胞浓度为 1 106 / ml ，取 1 毫升细胞悬液，用 PBS 洗三次，细胞重悬于 1 毫升 PI 染液中 ( PI 染液浓度 50 g /ml ，含 20 g /ml Nase A ) ， 4 染色 30 分钟，上机检测 。流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况，低于 G1 期的细胞 ( 亚二倍体 ) 为凋亡细胞，其占细胞总数的比例为凋亡细胞率。1 3统计学处理各试验均独立重复 3 次，应用 SPSS 13 0 统计软件进行方差分析，计量资料以 x s 表示，P

18、0 05 为差异有统计学意义 。2 结果2 1 MTT 法检测细胞增殖能力MTT 结果显示，siNA 干扰组在转染 12 h 、24 h 、 48 h 、72 h 及 96 h ，MTT 法检测各组 OD 值分别为0 082 0 008 、0 106 0 012 、0 160 0 022 、0 270 0 014 、0 438 0 017 ，转染 12 h 、24 h 、48 、72 h 及96 h 时 siNA 干扰组细胞生长速度较其他两组显著降低 ( P 0 05 ) ，空白对照组与阴性对照组在各时间点比较无统计学差异 ( P 0 05 ，图 1 ) ，以培养时间为横轴，平均 OD 值为纵

19、坐标绘制生长曲线，siNA 干扰组生长曲线低缓 ( 图 2 ) 。200国际神经病学神经外科学杂志2013 年第 40 卷第 3 期图 1 WISP -2 siNA 对 U251 胞增殖活性的影响。图 2 WISP -2 siNA 对 U251 胞生 曲 的影响。2 2 流式细胞仪检测细胞凋亡计分析结果显示 siNA 干扰组与阴性对照组 、空白培养 48 h 后收集细胞经流式细胞仪检测细胞对照组比较差异有统计学意义 ( P 0 01 ) ，阴性凋亡，结 果 显 示 : 空 白 组 平 均 凋 亡 率 为 ( 3 13 对照组与空白对照组比较差异无统计学意义 ( P =0 34 ) % ，阴性组

20、平均凋亡率为 ( 3 42 0 48 ) % ，0 698 ，图 3 ) 。siNA 干扰组平均凋亡率为 ( 16 59 1 40 ) % ，统201Journal of International Neurology and Neurosurgery2013 ，40 ( 3 )2 3 Western blot 法检测 WISP -2 、Bcl -2 、Bax 蛋 1 71 ) % 和阴性对照组 ( 49 07 1 35 ) % ，且差白的表达异显著 ( P 0 01 ) ，空白对照组和阴性对照组 Bcl -siNA 干 扰 组 WISP -2 蛋 白 表 达 相 对 水 平 为2 蛋白 表

21、达 水 平 比 较，无 明 显 统 计 学 差 异 ( P ( 18 67 1 40 ) % ，明显低于空白对照组 ( 70 180 05 ) 。siNA 干扰组 Bax 蛋白表达水平为 ( 31 62 1 82 ) % 和阴性对照组 ( 69 41 1 77 ) % ，且差 1 32 ) % ，明显高于空白对照组 ( 23 98 1 47 ) %异显著 ( P 0 01 ) ，空白对照组和阴性对照组和阴性对照组 ( 24 06 1 55 ) % ，且差异显著 ( PWISP -2 蛋白表达水平比较，无明显统计学差异 ( P 0 01 ) ，空白对照组和阴性对照组 Bax 蛋白水平 0 05

22、，图 4 ) 。siNA 干扰组 Bcl -2 蛋白表达水平比较，无明显统计学差异 ( P 0 05 ) 。为 ( 29 67 1 47 ) % ，明显低于空白对照组 ( 49 51图 4 siNA 沉默 WISP -2 对 U251 胞 WISP -2 、Bcl -2 、Bax 蛋白的影响3 讨论CCN 家族包括高半胱氨酸蛋白 6 l ( cysteine -rich 61 ，Cyr61 ) 、结缔组织生长因子 ( CTGF ) 、肾母细胞瘤过度表达基因 ( NOV ) 、WISP -1 、WISP -2 、WISP - 33 。CCN 家族间在氨基酸序列上有着高度的同源性和保守性，同时具有

23、相似的结构模块，与其他成员相比，WISP -2 在结构上缺少 C 末端结构模块且仅含有 28 个半胱氨酸，这意味着 WISP -2 可能与其他 CCN 蛋白存在功能上的不同 。在不同的肿瘤组织中，WISP -2 的分布及生物学作用不同，WISP -245-6的研正向或负向调节肿瘤的发展。Saxena 等究表明 WISP -2 在 4 种乳腺癌细胞系 ( MCF -7 、Z -75 、T -47 D 和 SKB2 ) 中都有高表达，而在正常乳腺上皮细胞中几乎没 有 检 测 到 WISP -2的 表 达。WISP -2 在乳腺增生性和乳腺导管原位癌组织中高表达，而在侵润性乳腺癌中低表达，在正常乳腺

24、组7，这表明 WISP -2在乳腺癌织中则完全缺乏表达的发生和发展中起着双向作用 。WISP -2的存在是非侵润乳腺癌细胞增殖雌激素受体所需，同时，它的存在 保 护 原 位 癌 细 胞 进 展 成 侵 袭 性 癌 细 胞。8Dhar 等 等用定量 PC 和免疫组化染色法对 7 例胰腺癌患者的癌组织和邻旁正常胰腺组织及 5 例慢性胰腺炎患者的胰腺组织的 WISP -2 mNA 和蛋白表达水平进行测定，结果显示在正常胰腺和慢性胰腺炎组织中，WISP -2 mNA 和蛋白高表达在胰腺导管和腺泡，而在胰腺癌组织中 WISP -2 mNA和蛋白低表达或不表达。本课题针对 WISP -2 基因设计筛选的

25、1 对特异siNA ，通过脂质体转染 U251 细胞后，检测 WISP -2 基因沉默对 U251 细胞增殖 、凋亡的影响，并检测干预后 WISP -2 、Bcl -2 及 Bax 蛋白的表达水平变化 。我们先采用 MTT 法检测 WISP -2 基因沉默后 U251 细胞株的生长活性 。我们发现经过 siNA 抑制 WISP -2 表达后，随着作用时间的延长，U251 细胞增殖的抑制作用逐渐增强，呈明显的时效依赖性 。绘制生长曲线后分析发现沉默 WISP -2 基因表达后，U251 细胞生长明显减缓，表明其增殖能力受到抑制 。运用流式细胞仪检测经干扰 48 小时后202国际神经病学神经外科学

26、杂志2013 年第 40 卷第 3 期的 U251 细胞凋亡率，发现细胞凋亡率从空白组平均凋 亡 率 ( 3 13 0 34 ) % ，阴 性 组 平 均 凋 亡 率 ( 3 42 0 48 ) % 上升到干预组的 ( 16 59 1 40 ) % ，提示 WISP -2 基因沉默能够增加诱导 U251 胶质母细胞株的凋亡 。通过以上实验我们发现 WISP -2 基因沉默后能够在体外有效的抑制 U251 细胞的增殖 、促进其凋亡 。为了进一步了解 WISP -2 基因沉默诱导 U251 细胞凋亡的机制，干扰 48 小时后，Western blot 检测 U251 细胞 WISP -2 蛋白的表

27、达，检测凋亡相关基因 Bcl -2 和 Bax 蛋白表达情况，结果显示，抗凋亡因子 Bcl -2 表达减少，促凋亡因子 Bax 表达增加，Bcl -2 / Bax 比值下降，由此可以推断调亡因子 Bcl -2 蛋白表达减少和 Bax 蛋白表达的上调是 WISP -2 蛋白下调后的早期事件，从而改变了 Bcl -2 与 Bax 的比值，使 Bcl -2 与 Bax 之间的平衡被打破，Bax 在结合了 Bcl -2 之后，余下的 Bax 即形成9-10Bax / Bax 同二聚体，发挥其凋亡作用 。WISP -2 siNA 诱导 U251 细胞发生凋亡可能与其改变凋亡相关蛋白 Bcl -2 、Ba

28、x 的表达，使 Bcl -2 / Bax 比值下降有关。综上所述，WISP -2 基因沉默能抑制 U251 细胞的增殖，U251 细胞的凋亡增加，并推测 siNA 沉默 WISP -2 基因诱导 U251 细胞的凋亡通过下调 Bcl -2 蛋白表达，上调 Bax 蛋白的表达来诱导 U251 细胞的 凋 亡。 试 验 结 果 在 一 定 程 度 上 证 实 了 WISP -2 在星形细胞瘤细胞增殖 、凋亡中发挥重要作用，同时提示我们是否可以将 WISP -2 作为临床治疗星形细胞瘤的分子靶点，或联合其他药物进行特异性靶向治疗，为星形细胞瘤的治疗开辟新的思路。参考文献1Holbourn KP ，A

29、charya K ，Perbal B The CCN family ofproteins :structure -functionrelationships TrendsBiochemSci ，2 0 0 8 ，3 3 ( 1 0 ) : 4 6 1 -4 7 3 2唐智，袁贤瑞 WISP -2 在人脑星形细胞瘤中的表达研究 国际神经病学神经外科学杂志，2 0 1 0 ，3 7 ( 1 ) :1 -4 3 InaderaH ，ShimomuraA ，Tachibana S Effect ofWnt -1 in-duciblesignaling pathwayprotein -2 ( WISP

30、-2 / CCN5 ) ， adownstream protein of Wntsignaling ，onadipocytedifferentia-tion Biochem Biophyses Commun ， 2 0 0 9 ， 37 9 ( 4 ) :9 6 9 -9 7 4 4Colston JT ，de la osa SD ，Koehler M ，et al Wnt -induced secreted protein -1 is a prohypertrophic and profibrotic growth factor Am J Physiol Heart Circ Physiol

31、 ，2 0 0 7 ，2 9 3 ( 3 ) :H1 8 3 9 -1 8 4 6 5 SaxenaN ，Banerjee S ，Sengupta K ，etal Differential ex-pression of WISP -1 and WISP -2 genes in normal and trans-formedhuman breast celllines Mol CellBiochem ，2 0 0 1 ，2 2 8 ( 1 -2 ) : 9 9 -1 0 4 6Banerjee SK ，Banerjee S CCN5 / WISP -2 : A micromanagerof br

32、east cancer progression J Cell Commun Signal ，2 0 1 2 ，6( 2 ) :6 3 -7 1 7HaqueI ，Banerjee S ，Mehta S ，et al Cysteine -rich 6 1 -connective tissue growth factor -nephroblastoma -overexpressed 5( CCN5 ) / Wnt -1 -induced signaling protein -2 ( WISP -2 )regulates microNA -1 0 b via hypoxia -inducible f

33、actor -1-TWIST signaling networks in human breast cancercells JBiol Chem ，2 0 1 1 ，2 8 6 ( 5 0 ) : 4 3 4 7 5 -4 3 4 8 5 8Dhar G ， Mehta S ， Banerjee S ， etal Loss ofWISP -2 /CCN5 signaling in human pancreatic cancer : a potentialmechanism forepithelial -mesenchymal -transition CancerLett ，2 0 0 7 ，2

34、5 4 ( 1 ) : 6 3 -7 0 9Sun SN ， JiaWD ， Chen H ，et al Docosahexaenoic acid( DHA ) induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells Int J Clin Exp Pathol ，2 0 1 3 ，6 ( 2 ) : 2 8 1 -2 8 9 1 0 Weaver CV ，Liu SP Differentially expressed pro -and anti -apoptogenic genes in response to benzene exposure : Immuno-histochemical localizationofp5 3 ，Bag ，Bad ，Bax ，Bcl -2，and Bcl -w in lung epithelia Exp Toxicol Pathol ，2 0 0 8 ，59( 5 ) : 2 6 5 -2 7 2 203