东洋纺 逆转录试剂盒.pdf

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1、科研用 中文说明书 OSAKA JAPAN TOYOBO CO., LTD. Life Science Department PCR 东洋纺 就 选 ReverTra Ace qPCR RT Kit (Code No.FSQ-101) TSB-029 12-03 目 录 1 前言 .1 2 产品内容.2 3 其他必需品 .3 4 使用方法 .4 5 相关操作步骤 .5 6 常见问题 .8 7 相关产品 .9 【注意】 本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试 剂用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护 用品，安全操作。 【保存】 所有组分请均保存于 -20条件

2、下。 1 1 前言 ReverTra Ace qPCR RT Kit 是基于制作 Realtime PCR 用模板 cDNA 的 目的而开发的高效率且使用简单方便的逆转录反应试剂盒。本产品采用了本公 司高性能逆转录酶 ReverTra Ace 和作为 Realtime PCR 目的片段短链 cDNA 合成的最优化反应成分，能够高效率地合成适用于 Realtime PCR 的 cDNA 模 板。此外，本产品简化了试剂盒的构成并且拥有快速的反应操作的特点，能够 在短时间内简单方便地进行 cDNA 合成。 本产品的试剂盒内没有添附 Realtime PCR 试剂。关于 Realtime PCR 产品

3、，推荐使 用本公司的 Realtime PCR 用试剂 Realtime PCR Master Mix 系列。（详情请参考7 相关产品的内容）。 本产品特征 1 对应各种不同长度目标片段的高效率逆转录 ReverTra Ace qPCR RT Kit 采用了最适合于 Realtime PCR 用 cDNA 合 成的反应缓冲液， 和以最恰当比例混合的 Primer 混合液， 对于各种不同长度的 目标片段， 不用摸索条件就能够进行高效率的逆转录反应。 2 反应时间短、 操作简单方便 ReverTra Ace qPCR RT Kit 只需要15 分钟的逆转录反应， 就能够对各种 长度的目标片段进行高

4、效率的逆转录反应。 此外， 在 Realtime PCR 的过程中， 会自动清除抑制反应的残留 RNA， 无须另外进行 RNase H 处理。 3 提高了与 Realtime PCR 试剂的兼容性 ReverTra Ace qPCR RT Kit 采用了对于 Realtime PCR 反应体系的影响 程度最小的成分，即使在 PCR 反应中添加了最多 20% 液量的逆转录反应液， 也能表现出良好的反应曲线（已通过使用本公司的 Realtime PCR Master Mix 确认）。最适合用于表达量较少的 mRNA 的高灵敏度检测。 2 2 产品内容 本产品包含以下几种试剂，每 10l 反应体系可

5、使用 200 次。 所有试剂请均保存在 -20条件下。 试剂名保存条件容量 5RT Buffer （Reaction Buffer+MgCl2+dNTPs） -20400l Enzyme Mix （ReverTra Ace reverse transcriptase +RNase Inhibitor） -20100l Primer Mix （Random Primer+Oligo(dT) Primer） -20100l Nuclease-free Water-201000l2 5RT Buffer 含有反应缓冲液、MgCl2、dNTPs 等 5 倍浓度的逆转录反应液 Buffer。溶 解时，可

6、能会出现白色沉淀，但不影响其品质。请使用振荡器等仪器使其混合 均匀，等完全溶解之后再使用。 Enzyme Mix 含有本公司高性能逆转录酶ReverTra Ace和RNase Inhibitor的混合酶液。 -20条件下不会冻结。 Primer Mix 含有 Random Primer 和 Oligo(dT) Primer 的混合引物，以最恰当的比例 混合，对于各种不同长度的目标片段都能进行高效率的逆转录反应。 Nuclease-free Water Nuclease-free 级别的灭菌蒸馏水。为避免影响聚合酶的活性，未经过 DEPC 处理。 3 3 其他必需品 除本产品之外，请再准备以下几

7、种试剂和仪器。 Thermal cycler 和 Incubator 本产品的建议使用温度为 37、 98、 以及 65， 请准备好符合条件的相 关仪器。 Nuclease-free Water 本产品已添附可使用 200 次的 Nuclease-free Water， 此外请再准备一些 Nuclease-free Water， 以便在稀释模板 RNA 时使用。 推荐使用未经过 DEPC 处理的 Nuclease-free Water。 也可以使用经 DEPC 处理过的水， 但残留的 DEPC 会抑制反应的进行， 因此请使用高压灭菌器彻底清除 DEPC 之后再使 用。 此外， 为防止核酸的混入

8、， 用于逆转录反应和 PCR 反应的 Nuclease-free Water， 建议和用于其它实验的 Nuclease-free Water 分开保存， 避免共用。 Total RNA 使用本产品， 可以把 Total RNA 直接作为模板使用。 从组织、 培养细胞等得 到 Total RNA 中， 作为表达分析对象的 mRNA 的含量通常为 1-2%。 除了进行 检测表达量极低的目的基因之外， 通常情况下都可以明显地检测到作为模板的 Total RNA。 通过 AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform) 法等提纯的 Total RNA 中， 混有基因组 DN

9、A。 对于在检测的目的基因中存在很多假基因的情况， 以及 跨内含子位置不能设计引物的情况， 可能是因为由混入的基因组 DNA 产生的 假阳性信号引起的。 请采取必要的措施 （如： DNase I 等） 清除基因组 DNA。 poly(A)+ RNA(mRNA) 利用 poly(A)+ RNA 和 Oligo(dT) 杂交后，选择性地分离出仅有 poly(A)+ 末端的 mRNA。在提纯过程中浓缩 mRNA， 是为了在高灵敏度下能够检测 mRNA。 但是， 与 Total RNA 相比 mRNA 更容易受到 RNase 的分解， 也不能以 ribosomal RNA 为内参来进行相对定量。 4

10、4 使用方法 （1）RNA 的变性 把 RNA 在 65条件下进行 5 分钟后，立即放于冰上冷却。 在经过以上步骤的处理后， 对于容易形成高级结构的 RNA可以提高逆转录的效率。 在进行以上步骤处理的时候， 请不要添加 5RT Buffer 和酶。 （2）反应液的配制 反应液组成 Nuclease-free Waterup to 10 l 5RT Buffer2 l RT Enzyme Mix0.5 l Primer Mix0.5 l RNA0.5pg-1 g Total volume10 l 除了在本试剂盒内添附的 Primer Mix 之外， 也可以使用基因特异性引物 （Gene Spec

11、ifi c Primer） 。 此时， 在反应体系中添加的最终浓度为 0.5pmol/ l（每 10 l 反 应体系添加 5pmol） 。 （3）逆转录反应 在 37条件下， 进行 15 分钟的逆转录反应。 在 98条件下， 进行 5 分钟的酶失活反应。 反应结束之后， 请保存于 4或者 -20条件下。 在进行 Realtime PCR 反 应时， 请在作为模板的反应液内直接添加或者稀释之后添加。 此温度条件是最适合本试剂盒组成成分的条件，一旦改变此温度条件，除了影 响酶的活性之外，对引物的退火效率、RNA 的清除效率、以及逆转录反应后的 酶失活效率等也会产生很大的影响。摸索条件的时候，请一定

12、要基于此温度条 件来进行实验。 把逆转录反应液添加到 Realtime PCR 反应液内时， 请不要超过 20% 的量。 添加 过量的逆转录反应液， 会降低 PCR 的反应效率， 不能进行准确的定量。 在使用基因特异性引物的情况下，特别是使用相同序列的逆转录引物和 PCR 引 物的时候，在逆转录反应时的非特异性退火是导致 PCR 非特异性扩增产物产生 的原因。此时，提高逆转录反应的温度（至 42-50） 可得到改善。 5 5 相关操作步骤 1 Total RNA 的 DNase I 处理 在通过 AGPC 法等提纯的 Total RNA 内混有基因组 DNA，可能会发生由 基因组 DNA 产生

13、假阳性信号的情况（请参考 p3），请根据以下的方法清除基 因组 DNA。 （1）反应液的配制和反应 反应液组成（例） Nuclease-free Waterup to 10 l Total RNA（10 g）X l 10DNase I Buffer1 l （10mM Tris-Cl, pH7.6, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2） RNase-free DNase I（10U/ l）0.5 l Total volume10 l 配制好以上的反应混合液后， 置于冰上反应1030 分钟。 （2）提纯（可使用一般的提纯试剂盒） 在反应液内添加 100 l 的 Nuclease-fr

14、ee Water、 100 l 的 TE 饱和苯酚， 用 vortex 使其充分混合后， 置于冰上 5 分钟。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 回收上清液。 添加 100 l 的氯仿后使其混合。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 回收上清液。 添加 100 l 的 5M 醋酸铵、 200 l 的异丙醇， 使其混合后置于 -20条件下 30 分钟。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 弃上清液。 在沉淀中加入 70% 乙醇。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 弃上清液。 在沉淀中加入适量的 Nuclease-free Water， 使其溶解。 6 2 Poly(A

15、)+ RNA 提纯法 在进行检测表达量较少的遗传基因时， 从Total RNA 中提取 poly(A)+ RNA 作为模板使用， 可以提高灵敏度。 在此介绍一个 poly(A)+ RNA 提纯法的例子： 通过使用 Oligo(dT) 结合磁珠的专用提纯试剂盒 MagExtractor -mRNA- （Code No. NPK-801） 的方法。 （1）DNase I 反应液的配制和提纯前的处理 反应液组成（例） MagExtractor -mRNA- 溶出液up to 100 l Total RNA（100 g）X l 10DNase I Buffer10 l RNase-free DNase

16、 I（10U/ l）1 l Total volume100 l 配制好以上的反应混合液后， 置于冰上反应15 分钟。 在反应液内添加 400 l 的溶解液 （含 2- 巯基乙醇） 和 800 l 的吸附液。 （2）反应和提纯 在新的 1.5ml 离心管内加入 250 l 磁珠。 使用磁力架 Magical Trapper （Code No.MGS-101） 或离心机等进行固液 分离 （B/F 分离） 后， 弃上清液。 添加上述经过事先处理的 Total RNA 液。 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 后， 在室温下放置 10 分钟。 进行固液分离 （B/F 分离） 后， 弃上清液。

17、添加 1ml 的洗净液。 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 。 进行固液分离 （B/F 分离） 后， 弃上清液。 添加1ml 的洗净液。 （转下页） 7 （接上页） 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 。 进行固液分离 （B/F 分离） 后， 弃上清液。 添加 1ml 的洗净液。 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 。 进行固液分离 （B/F 分离） 后， 弃上清液。 进行离心后， 再弃上清液。 添加适量的溶出液。 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 。 65、 2 分钟。 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 。 离心。 进行固液分离 （B/F 分离）

18、 后， 回收含有 poly(A)+ RNA 的上清液。 MagExtractor -mRNA- 的标准操作，需要反复进行 2 次上述的提纯。经过 2 次 反复提纯， 能够清除1次提纯未能完全清除的rRNA和基因组DNA。 通常情况下， 只需提纯 1 次，但如需要获取高纯度的 poly(A)+ RNA 时，请进行 2 次提纯。 关于此提纯法的详细介绍参考 MagExtractor -mRNA- 附带的使用说明书。 8 6 常见问题 1 在 Realtime PCR 时检测无信号，或者信号出现延迟。 原因对策 RNA 的纯度较低可能是由于配制 RNA 时残留的杂质抑制了逆 转录反应。 请重新提纯模

19、板 RNA。 RNA 被降解RNA 可能是被混入的 RNase 降解。请重新配制 RNA。此外，低浓度的 RNA 保存时，除更容 易被 RNase 降解外，由于被反应容器吸附， 实际的 RNA 的量会有所减少。建议避免把使 用过的低浓度 RNA 冻结保存后再使用，最好 每次使用时直接从高浓度的保存液稀释。 RNA 的量过多或者过少经确认，使用本产品时，添加 1pg-2 g 范围 的 RNA 的量都能够进行稳定有效的逆转录反 应。但是由于 RNA 的种类和品质等的不同， 可以进行反应的 RNA 的量可能会有所改变。 请适当增减模板 RNA 的添加量。 反应温度不当改变反应条件会对引物的退火效率、

20、 酶的活性、 逆转录后的酶失活、 模板 RNA 的清除效率等 多方面产生影响。 在进行实验时， 请务必要按 照本使用说明书上记载的条件来设定反应温 度。 逆转录反应液的添加量过多 经确认， 使用本产品时， 即使在 PCR 反应液内 添加最多 20% 的逆转录反应液也能表现出良 好的反应曲线。 但是使用不同的 PCR 试剂， 可 能会使表达量降低。 请减少逆转录反应液的添 加量。 2 在 Realtime PCR 时检测到非特异性的信号。 原因对策 发生引物的非特异性退火的 情况 （使用基因特异性引物 时） 使用基因特异性引物进行逆转录时， 引物的非 特异性退火是在 PCR 时出现非特异性信号的

21、 重要因素。 提高逆转录反应的温度， 可以有效 地提高退火的特异性。 请把反应温度设定在 42 -50的范围内。 9 7 相关产品 Realtime PCR 试剂 品名规格Code No. Realtime PCR 用 Master Mix （Probe Assay 用） Realtime PCR Master Mix 1ml5QPK-101 Realtime PCR 用 Master Mix（SYBR Green Assay 用） SYBR Green Realtime PCR Master Mix 1ml5QPK-201 Realtime PCR 用 Master Mix（SYBR Gre

22、en Assay 用） SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- 1ml5QPK-212 Realtime PCR 用 Master Mix（Probe Assay 用） THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 1.67ml3QPS-101 Realtime PCR 用 Master Mix（SYBR Green Assay 用） THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 1.67ml3QPS-201 配制 RNA 的相关试剂 品名容量Code No. 利用磁珠简单方便地提纯 mRNA 的试剂盒 MagExtractor -mR

23、NA- 5 次NPK-801F 利用磁珠简单方便地提纯 Total RNA 的试剂盒 MagExtractor -RNA- 100 次NPK-201 通过磁珠简单地进行提纯的专用磁力架 Magical Trapper 1 个MGS-101 Realtime PCR 用预混型 cDNA 合成试剂盒 品名规格Code No. Master Mix Version ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 200 次FSQ-201 去除基因组 DNA 试剂 +Master Mix Version ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA

24、 Remover 200 次FSQ-301 10 One-step PCR 试剂 品名规格Code No. One-step Realtime PCR 用 Master Mix （Probe Assay 用） RNA-direct Realtime PCR Master Mix 500 l5QRT-101 One-step Realtime PCR 用 Master Mix （SYBR Green Assay 用） RNA-direct SYBR Green Realtime PCR Master Mix 500 l5QRT-201 详情请浏览本公司中文网页 http:/www.bio- 制造 销售商 东洋纺（上海）生物科技有限公司 上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室 邮编：200122 交货期限 订货相关咨询 Tel:021-58794900 Fax:021-58794901 E-Mail:salesbio- 产品内容 技术相关咨询 Tel:021-58794142 Fax:021-58795259 E-Mail:techbio- http:/www.bio- 代理商资料：