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1、 快速快速 PCR 之空手套白狼之空手套白狼 近年来涌现出不少仪器和试剂，让 PCR 的速度越来越快。尽管这些工具让我们省了不少心，但 拥有快速 PCR 仪的实验室并不多，快速 PCR 酶也没有普及，我们只拥有普通的 PCR 仪和酶，但又 想 PCR 做得更快一点，那也并非异想天开。在本文中，就让 Bio-Rad 的专家来告诉你如何空手套白 狼，以最少的投入让 PCR 加快 3-4 倍。 最初的变性最初的变性 PCR 反应的最初步骤是在 94-96孵育 2-20 分钟。这个步骤将最初的模板变成单链，并激活热 启动的聚合酶。 但是即使是对全基因组 DNA 而言， 只要 94-95 2-3 分钟也
2、可以完全变性。有些热启 动的聚合酶需要 15-20 分钟才能达到最大活性， 但 如果选择抗体修饰的热启动酶，比如 iTaq，只需 98 15-30 秒就能完全激活。 循环中的变性循环中的变性 PCR 循环中的变性时间就没有最初那么严格 了，因为变性的模板只是 PCR 产物，它比初始模 板短得多，也简单得多。Bio-Rad 的专家用 iQ supermix 试验过，只要在 92变性 1 秒钟就足够 了，对产物几乎没有影响，包括 GC 含量高达 83.5%的产物。这与 Yap 和 McGee（1991）的结 论一致， 他们认为 500bp 以下的 PCR 产物就根本 无需 92的变性。 退火和延伸
3、退火和延伸 由于许多 DNA 聚合酶在很宽的温度范围内 （55-72）都具有高活性，所以 PCR 的退火和 延伸也可以压缩成一个步骤。少了一个步骤，时间 自然也节省了不少。在大部分情况下，标准的退火 时间（15-60 秒）和延伸时间（1 min/kb）其实是 过长了。引物与模板是高度同源的，因此在适当的 温度下只需要几秒钟就能完成退火。 一些优化好的 反应体系也能有效节省延伸时间。例如使用 iTaq， 15 秒的退火/延伸对 500bp 的产物而言就足够了。 优化退火/延伸的温度对PCR反应来说还是十 分重要的，因为它决定了反应的特异性。如果退火 温度太高，引物不能有效退火，会导致无产物或产
4、量低； 如果太低， 引物错配， 非特异扩增又会出现， 质量大打折扣。为了最大化速度和特异性，应使用 不牺牲产量的最高退火温度。 这时就需要一台梯度 PCR 仪来帮忙了。 特别提示：如果你要为快速 PCR 反应重新设 计引物，利用引物设计软件（如 Primer3）将会是 一个很好的选择。 你只需设定想要的引物 Tm 值就 行了。利用现成的引物也可以，只要在 5端多加 2-4 个碱基。不过，你还要确认一下这样做是否产 生了新的错配或自身配对。 最后的延伸最后的延伸 一般来说，PCR 最后的延伸步骤都是 70 5-10 分钟。尽管它被称之为延伸步骤，但是主要 还是为了让 PCR 产物退火形成双链，以便用于克 隆或电泳。 Bio-Rad的专家把时间缩短到30-60秒， 发现它对 100-1000bp 的 PCR 产物几乎没什么影 响。 循环数循环数 起始模板浓度高的话，PCR 的循环数小于 20 都是 OK 的。但如果靶 DNA 的拷贝数低（如 100 个拷贝），那必须做 35 个循环才能产生足够的产 物，在电泳中检测到。起始模板越少，模板就应该 相应增加。实际上，很多时候我们不清楚模板的量 有多少，那么为保险起见，最好还是做 35-40 个循 环。 快速 PCR 专题到此结束。如果大家还有什么 独家秘籍，欢迎与我们共享。 （生物通 余亮） 第 13 页，共 23 页下一页 返回