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1、溶剂对反相液相色谱中峰形影响 Solvent effect the HPLC performance in reversed phase Chromatography 忆峰（Yvan Lee） -201405-Sino 摘要:随着分析仪器的不断更新，HPLC 在常规分析工作中担任着愈来愈 重要的角色。其中反相色谱的高性价比及通用性，一直在高效液相色谱 法中占较大的比例。关于色谱洗脱条件的筛选，建立，许多文献集中在 流动相与色谱柱的调整，而样品溶剂相关的文章则较少。笔者以实际工 作经历中发现不同溶出介质对色谱峰形的影响为基础并结合相关的文 献， 就样品溶剂对反相液相色谱中峰形的影响进行了一个的归
2、纳与总结。 并对其中的机制提出了一些浅显的论述。 关键词: 体外溶出;HPLC;溶剂效应;峰形异常;缓冲容量;表面活性剂;离 子对试剂;方法开发 Abstract: As the analytical apparatus developing, HPLC is more and more popular and important, and reversed phase chromatography plays a big role for its cheaper and suitability. There are lots articles about setting the HPLC m
3、ethod focus on Mobile phase and column screening, but little on diluent. The author summaries some influences of sample solvent in reversed phase chromatography according to the daily experiments and references. Some mechanisms are presented in this article also. Keyword: Dissolution; HPLC; solvent
4、effect; abnormal peaks; buffer capacity; surface active agent; PIC; method development 高效液相色谱法由于其专属性好，灵敏度高，分析快速等优点被广 泛的使用在食品，化妆品，药品，石油化工，地质环境监测等诸多领域。 HPLC 按色谱柱填料的性质又分为反相色谱，正相色谱，离子交换色谱， 空间排阻色谱，手性色谱等 1。其中反相色谱由于其普适性原因占到了 HPLC 分析中大部分。 色谱分析者在工作中会经常遇到色谱峰型异常的问题。这一般可以 归结为峰过载，色谱柱柱头筛板堵塞，色谱柱损坏，系统死体积增大， 二次保留，溶剂
5、效应等 2。当出现色谱峰峰形异常时，进一针低样本量 （如 1uL） ，若峰型正态基本就可以断定为溶剂效应。溶剂效应对峰型的 影响有展宽，保留时间的飘移，峰面积的变化，分叉，双峰等 13，4。这 在定性与定量分析中都会导致分析工作者对结果的误判，对此笔者结合 相关文献和实际工作经历就反相色谱中溶剂效应的几种不同作用机制做 了以下简单的总结。 1. 溶剂强度溶剂强度 此处所述的溶剂强度指溶剂使用的是与流动相兼容的有机体系。 色谱分析者经常会遇到样品水溶解性不佳的问题，最简便的处理方式之 一便是以流动相中的纯有机相稀释并溶解样品。一般情况下都可以得到 满意解决，然偶尔也会发生峰形变异的问题。王丽 3
6、等在按照中国药 典2010 版二部测定瑞格列奈其左旋异构体时发现，以甲醇配置的 0.1mg/mL 的样品溶液的色谱峰形状随着甲醇的比例减低峰型趋于正态， 60%的甲醇/流动相 A 溶剂时才得到理想峰型。见图 X。 Organic phase strength in dilute impacts the performance of repaglinide and L-isomer Column：Chiral AGPTM 100*4.0mm,5um Mobile phase A:20mM KH2PO4(pH=7.0) , Mobile phase B:ACN Column temperature
7、: 25, Detector: UV 240nm, Inject volume:20uL Time(min)Time(min) Mobile phase A %Mobile phase A % Mobile phase B %Mobile phase B % 0 90 10 5 75 25 10 75 25 笔者认为这主要是样品中强洗脱剂在样品分配平衡建立初期产生的额外 洗脱作用力导致的结果。溶剂强度的影响大小受样品在固定相中分配能 力决定。表观上即样品的保留时间越长，溶剂强度过大导致的峰型的变 异程度/可能性越低。对于此类的影响,我们可以通过降低进样量，降低 溶剂强度，增加保留因子等手段加以
8、解决 1,2,4。 色谱峰的柱内展宽由多路径效应，纵向扩散，传质阻力三部分组成。 正常情况下上述影响只会导致导致峰的展宽而不会导致峰形变异，在检 测器上表现的就是一个正态的峰形。当溶剂强度大于流动相时，溶质谱 带在柱头处就会由于溶剂的额外洗脱作用而变形，导致前沿的肩峰出现。 Solute elution modelSolute elution model 1） Solute elution in normal condition Peak 2）Solute elution when diluent impacts the properties Peak 2.2. 溶剂溶剂与流动相与流动相的的兼
9、容兼容性性 为了兼顾难溶样品的溶解度，分析工作者有时会使用氯仿，乙酸乙酯， 苯等作为溶剂进样。此时的峰型变异的表现与 1 中所述的有所类似，但 机理仍有所不同。此时由于溶剂与流动相的兼容性不佳，直接包裹溶质 跳过色谱初期的保留过程， 待溶剂的分配平衡建立起来后溶质过于展宽， 甚至直接部分冲出色谱柱所致。这与谢孟峡等人的研究基本一致 3。 色谱工作者会把反相色谱的保留机制形象化为流动相与固定相 的分配过程，实际情况远比此复杂。有报道表明色谱柱中的流动相约只 有 50% 12是流动的。其余在载体间隙，固定相间隙，固定相表面中的 50% 则相对静止。溶质被固定相吸附必须先通过固定相表面的不动层。若溶
10、 质所用的溶剂与流动相兼容性不佳，则会显著影响溶质在溶剂与流动相 之间的传递，从而影响被固定相吸附的过程。 3.3. 溶剂溶剂 pHpH 的影响的影响 流动相的 pH 对于易解离化合物的保留有着显著的影响。 这是由解离 状态的化合物极性发生了显著的变化，导致固液分配系数发生了较大改 变所致。由于解离是个快速的动态过程，对色谱峰的展宽影响相对于溶 质的三个传统途径较小，所以 pH 对化合物色谱行为的影响在 HPLC 上多 体现的为保留时间的变化，而不是多个色谱峰。以下为 pH 对峰形影响的 一个较为显著的例子。 在以 0.1N HCl 作为溶出介质做（以下缩写 AT）的溶出曲线时，笔 者发现样品
11、图谱中 AT 峰所在的保留时间处出现了双峰（Figure 2） 。 Figure 2：pH of diluent influence the HPLC performance of At Column:GlobalC18150*4.6mm5um,MobilePhase:0.1%H3PO4/MeO H=30/70,Flow rate:1.0mL/min ,UVD 242nm，Inject volume:20uL. 由于有报道 AT 在酸性条件下不稳定 6，笔者初期推断是 AT 的降解 峰，溶出释放度拟加和计。但又发现不同溶出时间此两峰的比例几乎一 致。推断流动相中约 10mM 磷酸缓冲能力不足
12、7，在较低 pH（介质 pH 约 1.0）时，AT 在分配平衡中有两个差异较大的分配系数溶剂相与固 定相分配系数 1 以及流动相与固定相分配系数 2。初期由于溶剂在进入 色谱柱之前已经扩散，溶剂体积边缘以分配系数 2 洗脱，中部以分配系 数 1 洗脱直接导致在进样初期极短的时间内主峰被洗脱成两个溶质段。 当笔者调节了溶出样品的 pH 后峰形正态。 此类影响可以归结于流动相缓 冲浓度不足所致。 4.4. 表面活性剂的影响表面活性剂的影响 体外溶出实验中，十二烷基硫酸钠（SDS）为难溶性药物的方法开发 提供了一种简便的途径 8。B 缓释片中 SDS 的加入导致溶出速度的减低， 这可能是表面活性剂与
13、缓缓释制剂水化层表层中的亲水基团结合导致扩 散层增厚所致 9。笔者在做 B 缓释剂体外溶出时发现，增加了 0.2%SDS 的 0.1N HCl 溶出介质中的样品在进第二针时 B 中的 C 已经展宽到无法 辨别（Figure 3） 。 Figure 3: Medium（0.02%SDS，0.1N HCL）influence the HPLC performance of B dual compounds Column: SHISEIDO AQ-C18 150*4.6mm 5um,Mobile Phase: pH2.8 H3PO4/MeOH=95/5,Flow rate:1.0mL/min ,UV
14、D 280nm ， Inject volume:20uL. SDS 也是阳离子对试剂，溶剂中 SDS 在与样品溶剂竞争吸附 C18 柱作用 位点，导致第一针峰形拖尾。由于流动相洗脱强度较低，SDS 不易洗脱 出来， 卡比多巴和左旋多巴与固定相以两种保留机制作用-分配与离子交 换 4， 10， 导致后续峰变异。 笔者在流动相水相中增加了 0.01%SDS 与 0.05% NaCL（减低 C 的离子换作用）后峰形正态（Figure 4） 。此例实际上可以 引伸为溶剂离子强度对离子对色谱法的影响 4,10。 Figure 4: Neutralize SDS impact on B by adding
15、 SDS and NaCl in mobile phase Column: SHISEIDO AQ-C18 150*4.6mm 5um,Mobile phase : pH2.8 H3PO4（adding 0.01%SDS and 0.05%NaCL） /ACN=90/10，Flow rate:1.0mL/min ,UVD 280nm，Inject volume:20ul. 5.5. 大体积进样大体积进样的影响的影响 分析工作者在检测中有时会用到大体积进样来对痕量的物质进行定量。 这有时也会带来明显的峰型改变，这大多是由上述的综合影响所致，但 笔者还是单独列出了此情景中最简单模式样品初始体积大于
16、理论的 （0.4 倍基线体积 4）一个载荷量，最终导致的峰型展宽。此种情形的机 理类似于 TLC 中的点板不当导致的峰形拖尾 11 。 色谱洗脱过程是一个复杂的动态过程。在 HPLC 形成的初期，色谱工作者 对色谱柱直径、填充粒径、填充形状、管路直径等对峰形的影响都进行 过深入的论证。如今有报道称蛇形阻力管与 Z 形阻力管可以减少纵向扩 散效应，使峰型更加尖锐。除去这些硬件参数外，高通量分析时，色谱 工作者有时会忽略方法的耐用性，导致重现性较差。分析实验室的方法 转移时，对于复杂样品的分离，溶剂的改变有时会带来致命的后果 分离度的改变、峰型的改变、提取回收率的改变、溶液稳定性等。本文 所述的情
17、景希望可以为色谱工作者提供额外的问题解决途径。 参考文献： 1. 王娜，王海娇，丘明新等.高效液相色谱常见问题分析与策J.辽宁化 工,Vol.37 No.4,2008. 2. 王丽，申蓝慧，陈国清.浅谈样品溶剂对高效液相色谱行为的影响.中国 药事J.Vol.27 No.2,2013. 3. 谢孟峡，李建新.酚类化合物的反相高效液相色谱研究（II）.北京师范 大学学报（自然科学报）N.Vol.31 No.1,1995. 4. Lloyd R.snyder, Joseph J. Kirkland, Joseph L.Glajch. Practical HPLC Method Development
18、M. John Wiley 2nd Revised edition,1997. 5. 盛龙生，何丽一，沈文斌等著.药物分析.化学工业出版社M.2002 6. 韩金土，万里，杨晓炯.缓冲容量与 pH 的关系探讨.广州化工J.Vol.41 No.7,2013 7. 游本刚，梁娜，王亮等.尼群地平固体分散体体外溶出研究.抗感染药学 J.Vol.2 No.4,2005 8. 汉森，格雷著.宁保明，张启明译.溶出技术（第三版）M.中国医药科 技出版社，2007. 9. 李好枝.反相 HPLC 离子对色谱法在药物分析中的应用.沈阳药学院学报 N.Vol.4 No.3,1987. 10. 颜晓航.薄层色谱法操作技术控制要点分析.安徽医药J.16(9) 2012. 11. 刘国诠，余兆楼.色谱柱技术（第二版）M.化学工业出版社.2006