葡萄籽原花青素含量测定.pdf

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1、原花青素为植物多酚类天然抗氧化剂， 由不同数 量的单体黄烷 - 3 - 醇缩合而成， 这类化合物因在酸性 条件下加热生成花青素而被命名为原花青素。 原花青 素具有极强的抗氧化性， 清除自由基和抑制脂质过氧 化的能力，其抗氧化效果约为 V E 的 5 0 倍， V C 的 2 0 倍， 是目前发现的最强有效的氧自由基消除剂和脂质 过氧化抑制剂之一。 原花青素单体按不同聚合度形成 聚合体， 因构象或键合位置不同， 单体又有多种异构 体， 要测定每一成分的含量极为困难。目前国际上还 没有统一的原花青素检测方法， 其定量分析常用比色 法， 应用较多的是香草醛法， 该方法的原理（ 图 1 ） 基 于原花

2、青素 A 环化学活性较高 1 ， 其上的羟基可与香 草醛发生酚醛缩合反应， 在浓酸作用下形成有色的正 碳离子， 据此正碳离子的吸光度可测定原花青素的含 量。盐酸或硫酸均可作为反应过程的催化剂。 图1 酚醛缩合反应机理 该反应的灵敏度与酸浓度有关 2 ， 具体效果尚无 定论。本文将重点考察酸对显色的影响， 选择合适的 酸作为催化剂。再综合分析其他影响因素， 确定合理 的比色条件， 最终做出标准曲线。 1实验部分 1 . 1仪器和试剂 U V - 2 5 0 1P C 型分光光度计（ 日本岛津） ； 恒温水 浴锅（ 龙口市电炉制造厂） 。 原花青素标准品（ 天津尖峰天然产物研究开发公 司， 纯度9

3、 5 % ） ； 儿茶素标准品（ 美国 S i g m a 公司， 纯 度9 8 % ） ； 香草醛（ 天津光复精细化工研究所， 分析 纯） ； 甲醇、 硫酸、 盐酸均为分析纯； 实验用水为去离子 水。 1 . 2实验方法 首先扫描出反应体系的最大吸收波长， 然后考察 酸的影响， 确定反应的催化剂。 在此基础上， 考察其他 因素的影响， 确定比色条件。 在最佳比色条件下， 测定 原花青素及其单体儿茶素的标准曲线， 作为检测原花 青素含量的依据。 1 . 2 . 1配制试剂 （ 1 ） 配制样品溶液称取一定量的原花青素标准 品，用蒸馏水定容至一定体积，配成浓度为 0 . 0 1 0 . 5m g

4、 / m L 的原花青素标准品水溶液。 （ 2 ） 配制显色剂试剂 A（ 香草醛甲醇溶液） ： 称取一定量的香草醛，分别用甲醇定容至一定体积， 配成浓度为 0 . 5 % 、 1 % 、 2 % 、 3 % 、 4 % 、 5 %（ W / V ）的香草醛 甲醇溶液； 试剂 B（ 浓盐酸甲醇溶液） ： 量取一定体 积的浓盐酸， 分别用甲醇定容至一定体积， 配成浓度 为 1 5 % 、 3 0 % 、 4 5 %（ V / V ）的浓盐酸甲醇溶液；试剂 C （ 浓硫酸甲醇溶液） ： 量取一定体积的浓硫酸， 分别 用甲醇定容至一定体积，配成浓度为 2 0 % 、 3 0 % 、 4 0 % （ V

5、 / V ） 的浓硫酸甲醇溶液。 显色剂的配制采用一定浓度的 A 与 B 混合或 A 与 C 混合。 1 . 2 . 2确定最大吸收波长 取适量的标准品溶液， 与显色剂反应后， 以无水 甲醇作参比， 在可见光区扫描， 测定最大吸收波长。 1 . 2 . 3酸的选择 葡萄籽原花青素含量测定 ( 1 . 河北科技大学化学与制药工程学院， 河北石家庄0 5 0 0 1 8 ；2 . 张家口华源葡萄酒有限公司技术科， 河北张家口 0 7 5 6 0 0 ) 赵平 1 , 宋学娟 1 , 张月萍 1 , 贾宏海 2 , 于国强 1 摘要 酸性条件下， 原花青素与香草醛反应生成红色产物， 由红色产物的吸光

6、度可确定原花青素的含量。 实验首先考察了 酸对显色的影响， 确定以较低浓度的硫酸作催化剂。在此基础上， 进一步考察了其他因素的影响， 确立了稳定的比色条件： 硫酸 3 0 % 、 香草醛 4 % 、 反应温度 3 0、 反应时间 1 5m i n ， 并得出了标准曲线。 关键词 香草醛； 葡萄籽； 原花青素 中图分类号R2 8 4 . 2文献标识码A文章编号1 0 0 3 - 5 0 9 5 ( 2 0 0 7 ） 0 1 - 0 0 4 6 - 0 3 收稿日期 2 0 0 6 - 1 1 - 2 7 作者简介 赵平（ 1 9 6 5 - ） ， 男， 教授， 博士， 研究方向为化工 分离及

7、生物分离。 第3 0 卷第1 期 2 0 0 7年 0 1月 V o l . 3 0N o . 1 J a n . 2 0 0 7 两种显色剂分别与不同浓度的样品溶液反应， 测 定体系在最大吸收波长下的吸光度。 1 . 2 . 4比色条件的确定 以硫酸浓度， 香草醛浓度， 反应温度和反应时间 为考察因素， 设计一个4 因素3 水平的正交实验L 9 （ 3 4 ） 确定 比色条件。 1 . 2 . 5可靠性检验 重复性实验： 为了验证实验结果是否可靠， 在最 佳比色条件下， 分别采用两种酸作催化剂， 重复测定 4 次。 稳定性实验： 为了检验比色条件的稳定性， 在最 佳条件下， 分别采用两种酸作

8、催化剂， 每隔一定时间 测定其吸光度， 连续测定 1h 。 1 . 2 . 6标准曲线绘制 在最佳比色条件下， 分别绘制原花青素水溶液和 儿茶素水溶液的标准曲线。 2结果与讨论 2 . 1最大吸收波长的确定 在酸催化作用下， 原花青素分子中的间苯二酚与 香草醛发生缩合而形成有色的正碳离子， 即醛以 A 环 上的 6 、 8 位为亲核活性中心， 通过亚甲基桥键与多酚 分子交联， 形成大分子（ 见图 1 ） ， 使 A 环产生红色的 发光团（ 5 0 0n m ） ， 见图 2 。 图2 原花青素与香草醛络合物可见光扫描图谱 由反应体系的吸收曲线（ 图 2 ） 知， 最大吸收波长 为 5 0 0n

9、 m ， 与香草醛法的特征吸收一致。以后实验在 此波长下检测。 2 . 2酸的选择 两种显色剂分别与不同浓度的样品溶液反应， 结 果表明， 反应的灵敏度与稳定性不仅与酸的种类和浓 度有关， 而且与样品浓度有关。当体系中样品浓度较 低时， 盐酸法的灵敏度稍高于硫酸法， 二者均有较好 的透明度， 但后者的稳定性略胜一筹； 随体系中样品 浓度增加， 硫酸法的灵敏度升高， 且随硫酸浓度继续 增加， 其升高趋势越来越显著。当硫酸浓度高于 4 0 % 以后， 体系的透明度降低， 稳定性降低， 颜色发生变 化， 逐渐由红色变为蓝色。这是因为浓硫酸具有强氧 化性， 当浓度较高时， 氧化性更为显著， 使香草醛发

10、生 了自缩合反应， 生成了绿色产物 3 ， 从而使体系颜色 改变。 综上所述， 盐酸只有低浓度时灵敏度稍高， 其他 方面均逊于硫酸， 但考虑到高浓度的硫酸会导致副反 应发生， 影响检测结果， 本实验最终选择较低浓度的 硫酸作为催化剂。 2 . 3比色条件确定 表1 原花青素正交实验 L 9 （ 3 4 ） 水平因素 水平H 2S O4浓度 / % 香草醛浓度 / %反应温度 / 反应时间 / m i n 12 032 05 23 043 01 0 34 054 01 5 表2 正交实验方案及结果 序号H 2S O4浓度 香草醛浓度反应温度反应时间吸光度 111110 . 1 2 4 21222

11、0 . 1 3 8 313330 . 1 2 7 421230 . 2 1 3 522310 . 2 1 5 623120 . 2 0 4 731320 . 3 3 2 832130 . 3 5 8 933210 . 3 5 0 表3 正交实验结果极差分析及水平趋势图 H 2S O4浓度 香草醛浓度反应温度反应时间 水平 10 . 2 6 50 . 6 6 90 . 6 8 60 . 6 8 9 水平 20 . 6 3 20 . 7 1 10 . 7 0 10 . 6 7 4 水平 31 . 0 4 00 . 6 8 10 . 6 7 40 . 6 9 8 R0 . 7 7 50 . 0 3

12、00 . 0 2 70 . 0 2 4 最佳方案3223 水平变化图 由正交实验结果（ 表 2 ） 和极差分析（ 表 3 ） 可知， 各因素对显色反应的影响由大到小依次为硫酸浓度、 香草醛浓度、 反应温度、 反应时间。直观分析的结果 为： 硫酸 4 0 % ， 香草醛 4 % ， 反应温度 2 0， 反应时间 1 5m i n ； 极差分析结果为： 硫酸 4 0 % ， 香草醛 4 % ， 反应 温度 3 0， 反应时间 1 5m i n ， 与水平趋势图一致。 硫 酸在反应中起催化作用， 不改变平衡点， 浓度升高， 灵 敏度增加； 当浓度过高时， 会导致香草醛自缩合， 其产 物影响体系的吸光

13、度。 在保证不导致副反应发生的前 提下， 应选择较高的硫酸浓度。本实验最终确定硫酸 浓度为 3 0 % 。最佳比色条件为：浓硫酸 3 0 % ，香草醛 4 % ， 反应温度 3 0， 反应时间 1 5m i n 。 2 . 4可靠性检验 2 . 4 . 1重复性实验 (表4) 4 7 第 1 期赵平等： 葡萄籽原花青素含量测定 表4 香草醛硫酸法与香草醛盐酸法重复性实验 序号1234 A 5 0 0 （ H 2S O4） 0 . 2 2 60 . 2 2 20 . 2 2 60 . 2 2 6 相对误差 / %0 . 4 4- 1 . 3 00 . 4 40 . 4 4 A 5 0 0 （ H

14、 C l ）0 . 2 4 60 . 2 4 50 . 2 9 90 . 2 5 0 相对误差 / %- 5 . 4- 5 . 41 5 . 0- 3 . 8 重复性实验结果（ 表 4 ） 表明， 硫酸法的最大相对 误差在 1 . 3 0 % 之内，而盐酸法的最小相对误差大于 3 . 8 % ， 硫酸法的可靠性高。 2 . 4 . 2稳定性实验 (图3) 图3 香草醛硫酸法稳定性实验 稳定性实验结果（ 图 3 ） 表明， 盐酸法反应体系的 吸光度随时间延长而降低，在 6 0m i n内下降了 2 . 4 % ，硫酸法反应体系的吸光度长时间内基本不变， 因此， 硫酸法稳定性较好。 2 . 5标准

15、曲线绘制 图4 儿茶素与原花青素标准曲线 在最佳比色条件下， 分别测定原花青与儿茶素的 标准曲线， 结果见图 4 。由图 4 知， 当标准品浓度在 0 . 0 1 0 . 1m g / m L 之间时， 实验数据具有良好的线性 关系。回归方程分别为：儿茶素： C = 2 . 2 9 4 1 A + 0 . 0 0 8 1 ， R 2 = 0 . 9 9 89 ；原花青素： A = 2 . 3 8 16C - 0 . 0 0 59 ， R 2 = 0 . 9 9 91 。 用本法测定时， 二者均有很好的线性关系， 但相 同浓度的儿茶素吸光度高于原花青素， 以儿茶素为基 准绘制的标准曲线测定原花青

16、素时，含量会偏高， 这 也是香草醛法测定原花青素含量时应注意的问题。 3结 论 （ 1 ） 通过考察酸对显色的影响， 确定以较低浓度 的硫酸作催化剂。 （ 2 ） 通过考察硫酸浓度、 香草醛浓度、 反应温度、 反应时间等因素的影响，确立了稳定的比色条件： 硫 酸3 0 % ， 香草醛4 % ， 反应温度3 0 ， 反应时间1 5 m i n 。 （ 3 ） 根据实验确立的比色条件， 得出了原花青素 定量的标准曲线。 参考文献 1 2 3 Me a s u r eo f G r a p eS e e dP r o c y a n i d i n s U s i n gA c i d i f i

17、e dV a n i l l i n Z H A OP i n g 1 ,S O N GX u e - j u a n 1 ,Z H A N GY u e - p i n g 1 ,J I AH o n g - h a i 2 , Y UG u o - q i a n g 1 ( 1 . C o l l e g eo fC h e m i c a la n dP h a r m a c e u t i c a lE n g i n e e r i n g ,H e b e iU n i v e r s i s t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g

18、y ,S h i j i a z h u a n g 0 5 0 0 1 8 ,C h i n a ； 2 . T e c h n i cD e p a r t m e n to fZ h a n g j i a k o uH u a y u a nG r a p eW i n eL t d . ,Z h a n g j i a k o u0 7 5 6 0 0 ,C h i n a ) A b s t r a c t:P r o c y a n i d i n r e a c t s w i t h v a n i l l i n u n d e r a c i d c a t a l y

19、z i n g . T h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o c y a n i d i n i s d e t e r m i n e d a c c o r d i n gt ot h ea b s o r b e n c y o f r e d p r o d u c t . T h e e f f e c t o f a c i d a s c a t a l y z e r t o c o l o r r i n g w a s s t u d i e d . T h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s

20、w e r ed e t e r m i n e da f t e re x p e r i m e n ta ss u l f u r i ca c i d3 0 % ,v a n i l l i n4 % ,3 0 a n d1 5m i n u t e s .T h es t a n d a r dc u r v e r s o fc a t e c h i na n dp r o c y a n i d i nw e r eo b t a i n e d . K e yw o r d s:v a n i l l i n ；g r a p es e e d ； p r o c y a n

21、 i d i n R e v e r c h o nE ,D o n s iJ ， O s s e oLS . M o d e l i n go fs u p e r c r i t i c a l f l u i d e x t r a c t i o n f r o m h e r b a c e o u s m a t r i c e s J . I n d E n g C h e mR e s ， 1 9 9 3 ，（ 3 2 ） : 27 2 1 - 27 2 6 . S p i r oM ,S e l w o o dR M .T h ek i n e t i c sa n de q

22、 u i l i b r i ao ft e a i n f u s i o n .P a r t3 .R o t a t i n gd i s ce x p e r i m e n t si n t e r p r e t e d b yas t e a d y - s t a t em o d e J . JC h e mS o cF a r a d a yT r a n s ， 1 9 8 2 ， （ 7 8 ） : 2 9 5 - 3 0 5 . H o uK F ， Z h e n gQ， L iY R ， e ta l . M o d e l i n ga n do p t i m i z a t i o n o f h e r bl e a c h i n gp r o c e s s e s J . C o m p u tC h e mE n g ， 2 0 0 0 ， 2 4( 2 - 7 ) ： 13 4 3 - 13 4 8 . C / m g m L - 1 t / m i n 河 北 化 工 4 8 第 1 期 投稿情况咨询请打编辑部电话: 0 3 1 1 -8 5 0 5 1 5 7 9 ! ! ! !