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1、收稿日期: 2010 12 13修回日期: 2011 01 20 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 31070093/30801449) ; 福建省教育厅资助项目( 2007F5070) 作者简介: 方志锴( 1986 ) ， 男， 硕士研究生 研究方向: 生物化学和分子生物学 Email: fangzk1986 qq com 通讯作者洪文荣( 1956 ) ， 男， 教授， 博士 研究方向: 微生物制药 Email: hongwr56163 com 金色链霉菌接合转移体系的构建 方志锴1，洪文荣1，严凌斌1，潘成奇1，朱宝泉2 ( 1 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 3501
2、08; 2 上海医药工业研究院， 上海 200040) 摘要:以金色链霉菌 J13 基因组 DNA 为模板， 扩增金霉素 C6甲基化酶基因 ctcF 上下游序列作为两端同源交换臂， 在两臂 之间添加抗性筛选标记 neo 基因， 并在该基因上游加入组成型强启动子 ermE*， 以强化筛选标记 将该外源 DNA 序列插入 到质粒 pSET152， 构建重组质粒 pFD106 转化大肠杆菌 ET12567 后， 经接合转移导入金色链霉菌 J13 中， MS 平板上筛选阳 性接合子 PCR 检测表明， 重组质粒已整合到染色体 DNA 上 关键词:金色链霉菌;去甲基金霉素;接合转移 中图分类号:Q784
3、文献标识码:A 文章编号: 1671- 5470( 2011) 05- 0521- 04 Construction of the conjugal transfer system of Streptomyces aureofaciens FANG Zhi- kai1，HONG Wen- rong1，YAN Ling- bin1，PAN Cheng- qi1，ZHU Bao- quan2 ( 1 College of Biological Science and Technology，Fuzhou University，Fuzhou，Fujian 350108，China; 2 Shanghai
4、 Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040，China) Abstract:Two exchange arms，which were respectively located upstream and downstream of gene ctcF encoding methylase of the C6 position of chlortetracycline，were amplified by PCR from Streptomyces aureofaciens J13 genomic DNA The marker gene
5、 neo and constitutive promoter ermE*were then inserted between the arms With these fragments，we constructed pSET152- derived vector pNEO152 The recombinant vector was transformed to Escherichia coli ET12567 ( pUZ8002) ，and then transfered to S aureofaciens J13 by conjugation The positive transforman
6、ts were selected on MS plate After PCR identification，it was confirmed that pFD106 was integrated into the chromosome Key words:Streptomyces aureofaciens;demeclocycline;conjugation 去甲基金霉素属四环类抗生素， 具广谱抗菌活性， 是合成米诺环素和替加霉素的重要中间体1， 2 该 抗生素与金霉素结构相似， 仅在 C6上少一甲基 因此， 若能阻断金色链霉菌中金霉素生物合成基因簇上的 C6甲基化酶基因， 就有望获得去甲基金
7、霉素工程菌 传统上多利用物理和化学因子对金色链霉菌进行诱变， 但因效果不佳、 无法定向改造而受到很大限 制 3 随着分子生物学的发展， 目前可利用基因工程方法对不同微生物的相关基因和代谢途径进行操作， 获得特定代谢产物 国内外对金色链霉菌进行分子操作的报道， 多建立在制备原生质体的基础上， 步骤繁 琐、 操作复杂 4 而接合转移可在一定程度上绕过宿主的限制性障碍， 且操作简单、 宿主范围广， 目前已成 功应用于多种链霉菌5， 6 本研究以整合型质粒载体 pSET1527 为基础， 构建了重组质粒 pFD106， 并通过接合转移整合到染色 体中， 为金色链霉菌的基因操作创造了条件， 为最终获得去
8、甲基金霉素工程菌奠定基础 1材料与方法 11材料 111菌株与质粒大肠杆菌 Top10 为基因克隆受体菌， 大肠杆菌 ET12567( pUZ8002) 为接合转移供体 菌， 金色链霉菌( Streptomyces aureofaciens) J13 为接合转移受体菌， 以上菌株均由本实验室保存 质粒 pBR322、 surpercos1 及整合型质粒 pSET152 由本实验室保存 质粒 pBS- VII- 41F( 含红霉素启动子 ermE*) 由上海医药工业研究院邵雷博士惠赠 福建农林大学学报( 自然科学版) 第 40 卷 第 5 期 Journal of Fujian Agricult
9、ure and Forestry University ( Natural Science Edition)2011 年 9 月 112限制性内切酶和试剂限制性核酸内切酶、 连接酶、 Taq 酶和 DNA Marker 等均购自 TaKaRa 公司; DNA 回收试剂盒购自生工生物工程( 上海) 有限公司; 其他常规试剂参见文献 8 113培养基和抗生素金色链霉菌固体培养基为( NH4) 2HPO4003%、 KH2PO4001%、 MgSO46H2O 002%、 麸皮 50% 和琼脂 20% 细菌培养基为 LB 液体培养基， 接合转移使用的预萌发培养基、 MS 固体 培养基和 TSB 固体培
10、养基参见文献 8 LB 培养基中抗生素终浓度: 氨苄青霉素 100 gmL 1， 安普霉素 50 gmL1， 氯霉素 25 g mL 1， 卡那霉素 25 gmL1; 接合转移培养基中抗生素终浓度: 安普霉素 25 gmL1， 卡那霉素素 25 gmL 1， 萘啶酸 20 gmL1 12方法 121抗生素敏感性实验融化已灭菌的培养基， 当温度降到约 45 时分别加入适当梯度的抗生素 凝 固后涂布金色链霉菌单孢子菌悬液， 35 培养 5 d， 以生长情况来确定金色链霉菌对抗生素的敏感性 122引物设计根据推测的 C6 甲基化酶基因 ctcF 两端序列设计两端交换臂引物: JH1、 JH2， JH
11、3、 JH4; 以质粒 supercos1 上的卡那霉素抗性基因 neo 为模板， 设计引物 N1、 N2 为方便基因克隆， 引物上分别引入 相应的酶切位点: JH1: 5-GGATCCGCGGAGCTCGATATCAGTACGACCTTCGGT- 3 ( BamHI， EcoRV) ; JH2: 5-CTCGAG GGTACCAATGATCTCGCCGTTGTCCGTCATG- 3( Xho， Kpn ) ; JH3: 5- ATA CTCGAGAGCGTGGTGCCCGAA- 3( Xho ) ; JH4: 5-GATATC GTCGACAGATCTAACGCGACCTCCCGTCTCG-
12、 3 ( EcoRV， Bgl) ; N1: 5- GAT GGTACCACGTAGAAAGCCAGTCCG- 3( Kpn ) ; N2: 5- GCACTCGAGAGAACTCCAGCATGAGATC- 3( Xho ) 123金色链霉菌的接合转移大肠杆菌感受态的制备和转化采用 CaCl2法9 重组质粒需在 pUZ8002 的协助下， 通过接合转移 8 从大肠杆菌 ET12567 导入金色链霉菌中 接合子的初筛利用抗性筛选和孢子 PCR10 ， 复筛需提取染色体 DNA8 进行 PCR 2结果与讨论 21金色链霉菌对抗生素的敏感性试验 表 1金色链霉菌对不同抗生素的敏感性1) Table
13、1The antibiotic sensitivity of S aureofaciens 抗生素 质量浓度/( gmL 1) 01252550 卡那霉素+ 大观霉素+ 安普霉素+ 1)+ 正常生长; + 少量生长; 无法生长 为确定接合转移系统的筛选标记以选择合适的 载体， 考察了金色链霉菌对链霉菌筛选常用的 3 种 氨基糖苷类抗生素的敏感性( 表 1) 从表 1 可见， 金 色链霉菌对所试抗生素均敏感， 其中卡那霉素对其 最小抑制浓度为 25 gmL 1， 安普霉素的最小抑 制浓度为 125 gmL 1 故本研究确定以卡那霉 素抗性基因 neo 为筛选标记 该结果也证明了 pSET152
14、载体上安普霉素抗性基因 aac( 3) 的可用性 22接合转移质粒 pNEO152 的构建 以金色链霉菌染色体 DNA 为模板， JH1 与 JH2、 JH3 与 JH4 为引物， 分别进行 PCR， 扩增得到两端同源 交换臂 ctcF- 1 和 ctcF- 2 以质粒 surpercos1 为模板、 N1 与 N2 为引物， 扩增抗性筛选基因 neo( 图 1) ctcF- 1 和 ctcF- 2 分别经 pMD19- T 克隆得到阳性克隆子， 依次命名为 pFD101 与 pFD102 pFD101 经 BamHI- Xho 酶切， 回收 1934 bp 片段， 与经同样双酶切的 pFD1
15、02 片段( 4553 bp) 进行酶连并转化， 得到阳性转化子， 命 名为 pFD103 pFD103 和 pBR322 分别经 BamHI- Hind酶切， 依次回收 3831( 含 ctcF- 1、 ctcF- 2) 和 4015 bp 片段， 经连接和克隆等操作， 得到阳性克隆子， 命名为 pFD104 回收 Kpn/Xho酶切过的 pFD104 片段 ( 7836 bp) 和 Kpn/Xho酶切过的 neo( 1267 bp) 与 pBS- VII- 41F 经 Kpn切下的 469 bp 片段( 含红霉素 启动子 ermE*) ， 经酶连转化等操作得到阳性转化子， 命名为 pFD1
16、05 pFD105 经 EcoRV 酶切， 回收5514 bp 片段， 与同样经 EcoRV 酶切后的 pSET152 相连， 经转化等操作得到阳性克隆子， 命名为 pFD106， 其图谱见 图 2 pFD106 的酶切鉴定如图 3 所示， 该质粒经 Bgl酶切， 得到 8379 与 2850 bp 的带; 经 Xho与 Kpn 225 福建农林大学学报( 自然科学版)第 40 卷 酶切， 可得到 5794、 3699、 1267 和 469 bp 的带， 与预测相符 1 ctcF- 1; 2 ctcF- 2; 3 neo; M DL5000 图 1交换臂及抗性基因的 PCR 产物电泳检测图
17、Fig1Electrophoresis analysis of PCR products and antibioctic resistance gene 图 2质粒 pFD106 图谱 Fig2Map of the plasmid pFD106 1 pFD106/Bgl; 2 pFD106/Xho- Kpn; M - EcoT14消化的 DNA 标准品 图 3重组质粒 pFD106 的酶切鉴定 Fig3Restriction endonuclease identification of recombinant plasmid pFD106 23金色链霉菌接合转移体系的建立与优化 以金色链霉菌的
18、孢子和菌丝作为接合转移的受体， 选取金色链 霉菌固体培养基、 MS 和固体 TSB 培养基作为接合转移培养基， 结果 显示， 以菌丝作为受体时， 所有的培养基上几乎无接合子( 经验证， 个 别几个均为假阳性菌落) ， 而以孢子作为受体时， 仅 MS 培养基上长出 接合子 因此， 在金色链霉菌接合转移体系中， 孢子为最佳的受体形 态， MS 为最理想的接合转移培养基 当供体大肠杆菌 ET12567 和受体金色链霉菌在同一平板上生长 时， 两者之间不可避免会相互竞争 而大肠杆菌的生长速度快于金色 链霉菌， 若其量过大， 则金色链霉菌生长受到抑制( 极其缓慢， 甚至无 法生长) ， 接合转移率大幅降
19、低( 甚至为 0) 试验中， 大肠杆菌数量级 保持在 108( 个) ， 而金色链霉菌孢子量分别控制在 106 108 接合转 移试验中发现， 孢子量为 106和 107时， 仅长出零星接合子， 而当孢子 量控制在 108时， 可得到较多接合子( 接合子数平均在 12 个) 链霉菌孢子经过热激处理后， 37 预培养 2 3 h 会大幅缩短其萌发时间， 从而在细菌生长最旺盛时 进行高效率的接合转移 对热激的时间和温度进行考察， 分别设立了不同的组合50 +10 min、 50 +15 min、 55 +10 min、 55 +15 min， 接合转移率均无大的变化 利用抗性标记来筛选接合子， 则
20、抗生素的覆盖时间至关重要， 应选择在质粒转入到链霉菌， 且抗性基 因充分表达之后 若覆盖时间太早， 则接合转移不完全 而覆盖的时间太迟， 链霉菌成片生长， 难以区分单 菌落， 且细菌和链霉菌对抗生素的敏感性降低， 假阳性菌落大量出现 本试验证明， 16 18 h 为抗生素覆 盖的最佳时机 经试验确定， 金色链霉菌的接合转移优化体系为: 供体 ET12567( 带 pUZ8002 与重组质粒) 的过夜培 养物转接到含抗生素的 LB 中， 37 培养至 D600 nm为 06 时收集菌体， 用新鲜 LB 培养基洗涤菌体 2 次备 用 将金色链霉菌孢子悬浮于 5 mL 005 molL 1TES 缓
21、冲液( pH 80) 中， 50 水浴热激 10 min， 冷却至 室温后加入等体积预萌发培养基， 37 振荡( 250 rmin 1) 培养 2 h， 离心收集孢子并重悬于适量的无菌 水中， 在混合器上振荡打散孢子， 按 108 108与大肠杆菌细胞等量混合， 涂布在 MS 培养基上， 16 20 h 后 用含 1 mL 的无菌水( 含适量抗生素及萘啶酮酸) 覆盖， 置 32 培养 3 4 d 后即可看到接合子 24接合子的获得及验证 由于 pFD106 属整合型质粒， 转入到链霉菌中后， 不能独立复制， 而是整合到菌株的基因组上 7 因 此， 若接合子中的抗性筛选基因 neo 能表达， 即
22、可在覆盖卡那霉素的平板上生长 通过卡那霉素筛选， 得到 抗性菌落， 挑选其中 4 株， 分别命名为 S1、 S2、 S3 和 S4 该 4 株抗性菌株在含萘啶酸和卡那霉素的平板上 经 3 次传代培养， 彻底清除大肠杆菌 ET12567/pUZ8002， 然后进行孢子 PCR 初检， 均可扩增出 neo 抗性片 325 第 5 期方志锴等: 金色链霉菌接合转移体系的构建 段( 图 4 第 1 4 泳道) ， 而出发菌株则无此条带( 图 4 第 5 泳道) ， 因此初步判定 pFD106 已整合到染色体 上 选取 S1 提取染色体 DNA， 分别以 N1 与 N2、JH1 和 N2、 N1 和 J
23、H4 为引物， 均可扩增到预测大小的片 段( 图 5 第 3、 6、 9 泳道) ， 而出发菌株在上述 3 种情况下都未扩增出相对应片段( 图 5 第 1、 4、 7 泳道) 1 4 接合子孢子; 5 金色链霉菌 J13; M - EcoT14消化的 DNA 标准品 图 4亲本株和接合子的孢子 PCR 验证 Fig 4Spore PCR confirmation of wild type and cojugon 1 3 N1/N2 扩增 J13/pFD106/S1; 4 6 N1/JH4 扩增 J13/pFD106/S1; 7 9 JH1/N2 扩增 J13/pFD106/S1; M DL50
24、00 DNA 标准品 图 5接合子 S1 的 PCR 验证 Fig5PCR confirmation of S1 25接合子中抗性基因的表达 质粒 pFD106 整入金色链霉菌的染色体后， 对卡那霉素和安普霉素抗性均达200 gmL 1以上， 进一 步证实了筛选标记的有效性 质粒上 aac( 3) 和 neo 基因在金色链霉菌内发生表达， 赋予该菌对卡那霉 素和安普霉素的高抗性 3讨论 链霉菌基因转移操作， 无论是原生质体转化或电转化， 还是接合转移， 其成败很大程度上取决于筛选 标记是否在受体菌中实现表达 合适的抗性标记可大大减少筛选工作量， 直接影响试验效果 安普霉素抗 性基因 aac(
25、3) 普遍应用于多种链霉菌质粒， 而卡那霉素抗性基因 neo 的表达量受环境影响较大 8 ， 因 此本研究中在该基因上游连入组成型启动子 ermE*， 以增强该基因的表达 质粒 pFD106 携带了来自链霉菌温和噬菌体 C31 的整合位点 attP、 整合酶位点 int， 以及适用于接合 转移的 oriT， 能将整个质粒整合进染色体中7 由于染色体上含同源序列， 在无抗生素选择压力的情况下， 经传代培养后， 部分菌株将发生同源重组， 经定向筛选， 可获得阻断目的基因的工程菌 参考文献 1许菊彦， 姚天爵， 李焕娄 从金霉素链霉菌 38 选育产去甲基金霉素的突变株 J 微生物学报， 1974，
26、14( 1) : 66 69 2邵昌， 王涛， 杨志钧， 等 替加霉素的合成方法: 中国， ZL200710171556 7 P 2009 06 10 3缪克排 金色链霉菌发酵条件优化及高产菌株选育的新方法 D 杭州: 浙江大学， 2005 4BRNKOV Z，FARKAOVSK J，RUSNKOV A Formation of streptomyces protoplasts during cultivation in liquid media with lytic enzyme J Nova Biotechnologica， 2008， 8: 35 44 5HOU Y H，LI FC，WA
27、NG S J，et al Intergeneric conjugation in holomycin- producing marine Streptomyces sp strain M095 J Microbiological Research， 2008， 163: 96 104 6JORGENSEN H，DEGNES K F，DIKIY A，et al Insights into the evolution of macrolactam biosynthesis through cloning and comparative analysis of the biosynthetic ge
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