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1、实验二蛋白质的呈色反应，沉淀反应实验人：刘彦汶 学 号：20100331024 班 级：针外2010七同组人：曲 畅 试验日期：2012年3月15日 指导老师：路雪雅一 实验目的1 了解蛋白质的性质。2 掌握蛋白质的鉴定方法。3 理解蛋白质呈色反应和沉淀反应原理。二 实验内容1 蛋白质的呈色反应。2 蛋白质的沉淀反应。三 实验器材水浴锅（100摄氏度），试管（若干），烧杯，一次性滴管，酒精灯，漏斗，火柴，滤纸四 实验试剂11：10鸡蛋白溶液 210%NaOH 31%硫酸铜 4尿素 501%茚三酮乙醇液 6025%丙氨酸溶液 7饱和硫酸铵溶液 8固体硫酸铵 905%NaOH1005%硫酸锌 11
2、10%磺基水杨酸 1210%Hcl 131%HAc 1410%HAc15.无离子水五 实验原理及操作步骤（一） 蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应是蛋白质中某些氨基酸特殊基团与一定的化学试剂作用而呈现的各种颜色反应，可作为检查蛋白质是否存在的参考。另外，不同的蛋白质中氨基酸的种类及含量各不相同，而在某些蛋白质内还可能缺乏呈某种颜色反应的氨基酸。因此不但不同蛋白质呈色反应的强度不同，而且某些呈色反应在某种蛋白质可能不存在。本实验操作两种呈色反应：双缩脲反应与茚三酮反应，用以比较和鉴别不同的蛋白质。1 双缩脲反应【实验原理】在浓碱液中，双缩脲能与硫酸铜结合生成紫色或紫红色的复合物，这一呈色反应为双缩
3、脲反应，凡含有两个及多个肽键（酰胺键）的化合物都可能发生此反应，故蛋白质及二肽以上的物质都有此反应，但除肽键外，有些基团如CSNH，C（NH2）NH等也有双缩脲反应，因此，一切蛋白质或多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的不一定都是蛋白质或多肽。【操作】（1） 取小试管一支，加1：10鸡蛋白液2滴，10%NaOH溶液5滴及1%硫酸铜溶液2滴，混匀，可见 溶液变成紫色。（2） 另取一小试管，加一小匙尿素（绿豆大小），小火加热至熔，嗅其气味为（臭鸡蛋味）。继续加热使之凝固，这固体是（双缩脲），加水10滴，10%NaOH溶液5滴，1%硫酸铜溶液2滴，可见 白色固体溶解，后溶液变紫色。实验结论在过碱条件
4、下，蛋白质可以和硫酸铜发生双双缩脲反应，但有双缩脲反应的不一定都是蛋白质或多肽。2 茚三酮反应【实验原理】凡含有自由氨基的化合物例如蛋白质，多肽，各种氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸例外）和其它伯胺化合物（包括氨）与茚三酮共热时，能生成紫蓝色化合物，这种反应即茚三酮反应。【操作】注意：用酒精灯加热时，酒精灯不要随便移动，加热试管口不能对着人，不能用吹气的方式熄灭酒精灯，以免出现危险情况。大试管121：10鸡蛋白溶液/滴60丙氨酸溶液/滴06蒸馏水/滴101001%茚三酮乙醇液/滴66混匀，水浴锅加热约5分钟，待冷却后观察结果结果溶液变成淡紫色溶液变成紫色实验结论1号试管中，蛋白质与茚三酮共热时，发生茚
5、三酮反应；2号试管中，由于丙氨酸含有自由氨基，而发生茚三酮反应，由此得出，含有自由氨基的化合物与茚三酮共热时能发生茚三酮反应。（二） 蛋白质的沉淀反应当维持蛋白质胶体溶液的稳定因素（水化膜和电荷）遭到破坏时，蛋白质析出。如果是非变性沉淀，例如加入中性盐或者在低温下加入有机溶剂脱水，则除去沉淀剂后，蛋白质仍可溶解，此即可逆的沉淀反应。如果是变性沉淀，例如加入重金属盐类，生物碱试剂或加热，则沉淀剂不易除去，沉淀常不能再溶解，此即不可逆的沉淀反应。1. 蛋白质的盐析【实验原理】水溶液中的蛋白质在高浓度的中性盐硫酸铵，硫酸镁，氯化钠等中析出的现象，称为盐析作用。盐析作用包括两种过程：1）大量电解质破坏
6、了蛋白质的水化膜从而出现沉淀。2）电解质中和了蛋白质分子所带的电荷而沉淀。中性盐能否沉淀各种蛋白质常决定于中性盐的浓度，蛋白质的种类，溶液的pH值以及蛋白质的胶体颗粒。颗粒大者比颗粒小者容易沉淀，如球蛋白多在半饱和的硫酸铵溶液中析出，而清蛋白常在饱和的硫酸铵溶液中析出。【操作】（1） 取5ml鸡蛋白溶液于大试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀，静置20分钟后，观察现象是 溶液中有少量的白色沉淀。（2） 过滤，收集透明滤液，滤液中会有清蛋白，若溶液混浊，须重复过滤至透明为止。（3） 取1ml滤液加固体硫酸铵（0.5g）使达到饱和，边加边振摇到溶液出现混浊，再向混浊液加1.5-2.0ml水,观察现
7、象是 先产生明显的白色沉淀加水后沉淀逐渐溶解溶液变澄清实验结论第一步产生的沉淀为球蛋白，第三步中产生的沉淀为清蛋白。水溶液中的蛋白质可在高浓度的中性盐中析出，而蛋白质的胶体颗粒的大小不同，则析出所需的中性盐的浓度也不同。2重金属盐类沉淀蛋白质【实验原理】蛋白质在碱性溶液中带有较多负电荷，当它与带正电荷的重金属离子结合时即可生成不溶解的沉淀，重金属盐类沉淀蛋白质能引起蛋白质的变性，而中性盐类即使加入量很多也不改变蛋白质原来的性质。【操作】试管121：10鸡蛋白溶液/ml1105%NaOH/滴1010%Hcl/滴0105%ZnSO4/滴66现象溶液变浑浊溶液无明显变化实验结论在碱性溶液中，带负电荷
8、的蛋白质与带正电荷的重金属离子结合而生成不溶解的沉淀，而酸性条件下，带负电荷的蛋白质与带正电荷的重金属离子则不会产生沉淀。（三） 蛋白质变性与沉淀【实验原理】由于温度升高破坏了蛋白质分子内部的化学键，引起蛋白质变性，因此几乎所有蛋白质都可因加热而凝固。蛋白质在其等电点时不带电荷，或带等量的正负电荷，此时若温度升高则容易出现沉淀。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正或负电荷，较为稳定。如果过酸或过碱则易变性，此时若温度升高，虽变性却不沉淀。在冷却后加酸或加碱调节PH值达蛋白质等电点时则有沉淀析出。【操作】（1）取4支试管，编号，按下表加入试剂试剂（滴）/管号12341：10鸡蛋白溶液202020
9、201%醋酸010010%醋酸0010005%NaOH0005将4支试管同时放在沸水浴中加热5分钟，观察并记录各管蛋白质出现的现象，解释变化原因现象溶液变浑浊溶液变浑浊，较试管一更明显无变化无变化原因温度升高破坏了蛋白质分子内部的化学键，引起蛋白质变性因为溶液中加入1%的醋酸后更接近等电点，所以沉淀现象更明显因为溶液过酸则使其易变性，温度升高，虽变性却不沉淀因为溶液过碱则使其易变性，温度升高，虽变性却不沉淀（2）取出试管，冷却后于第3管中慢慢滴入10% NaOH溶液，观察现象是溶液先变浑浊，然后浑浊慢慢溶解，其原因是 加入碱溶液后使得溶液PH值达到蛋白质的等电点，所以有沉淀析出，加入过量的碱溶液使溶液偏离等电点，沉淀溶解。（3）向第4管中慢慢滴入10%醋酸，观察现象为 溶液先变轻微的浑浊，然后浑浊慢慢溶解，其原因是 加入酸溶液后使得溶液PH值达到蛋白质的等电点，所以有沉淀析出，加入过量的酸溶液使溶液偏离等电点，沉淀溶解。实验结论由于温度升高破坏了蛋白质分子内部的化学键，引起蛋白质变性，因此蛋白质可因加热而凝固。蛋白质在其等电点时，若温度升高则容易出现沉淀。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子较为稳定。如果过酸或过碱则蛋白质易变性，此时若温度升高，虽变性却不沉淀。在冷却后加酸或加碱调节PH值达蛋白质等电点时则有沉淀析出。