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1、女性卵泡液中抑制素B的分离纯化及其特征(2)8.蛋白样品的透析：将需要透析的样品装入截流分子量为14 000的透析袋中，袋两端用封口夹封闭后浸没于透析液（ddH2O或上样缓冲液）中，磁力搅拌，每0.5h更换1次透析液，重复3次。9.蛋白样品的浓缩：将透析处理后的样品连同透析袋包埋于PEG-20000中，浓缩样品至所需体积后回收样品。结果一、Bradford法绘制BSA标准曲线根据标准的OD570值绘制出BSA标准曲线，求得R2=0.985,公式为y=0.0772x+0.8493.BSA标 准 品 的OD570值 分 别 为：0.849、1.103、1.158、1.313、1.497、1.621
2、、1.776、1.830μg/μl.二、3种去除卵泡液中的高丰度蛋白方法 的比较按标准蛋白曲线回归方程计算出原样品的蛋白总量为37mg,经3种方法处理后样品的蛋白总量分别为22.5mg、17.1mg、32.8mg.结果表明，样品经丙酮、乙醇、乙腈处理后分别可清除60.9%、46.3%、88.7%的高丰度蛋白，即乙腈法处理卵泡原液去除高丰度蛋白是最优的方法。（图2）.三、DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化蛋白结果DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化蛋白共收集39管蛋白，从洗脱曲线可看出，洗脱峰出现在第14管和第15管（图3）.四、Rotofor System蛋
3、白 分 离 及 等 电 点 鉴 定结果对Rotofor System所收集的20管样品处理后用Inhibin B Gen II ELISA kit检测每管中INH-B的浓度，其中第3和第4管INH-B的浓度分别为590pg/ml和750pg/ml,蛋白质等电点（isoelectricpoint,pI）分离法测得第3和第4管pI值分别为4.5和4.6.由此可推断出卵泡液中INH-B的pI在4.55左右（表1）.五、目的蛋白INH-B的回收率采用Inhibn B Gen II ELISA kit试剂盒绘制INH-B浓度测定标准曲线，INH-B标准品的浓度分别为0、10、30、100、250、500
4、、1 000pg/ml,其对应OD450值 依 次 为0、0.051、0.142、0.503、1.192、2.085、3.179. 其 中R2=0.9718,公 式 为y=298.95x-35.445（图4）.以100ml原始卵泡液为初始样品，样品中总INH-B的含量为17.3μg.经乙腈、DEAE-Sepha-dex A-50柱层析、Rotofor System蛋白分离3次处理，依次编号为1、2、3,各步样品中INH-B的含量分别为10.7、8.9、6.7μg,经过3次纯化后回收率为38.70%（表2）.讨论女性体内INH-B由卵巢中、小窦卵泡颗粒细胞产生，具有反馈性抑制垂体FS
5、H分泌和调节生殖细胞发育的 重要功 能，可直接反映卵巢储备功能。INH-B的监测在女性生殖及辅助生殖技术中的应用有重要意义10.男性体内INH-B是直接由睾丸分泌的二聚体糖蛋 白 激 素，对 多 种 外 源 性 激 素 起 反 应。血 清INH-B水平受年龄、睾丸体积、青春期发生时间、标本采集时间、不同人群等多种因素影响。INH-B能直接反映睾丸的精子发生，可作为临床评价男性生育力的重要指标11-12.睾丸穿刺活检是诊断无精子症的金标准;,但血液中INH-B水平检测作为部分替代和补充，可作为睾丸生精障碍的间接诊断依据，但这一依据的准确性依然存在争议13-14.因此，随着生殖医学的发展，直接以精
6、液为研究、检测材料的方法引起人们的兴趣。现有的文献中，最新的对于血液中INH-B存在形式的研究已经很完整15,而对于男性精液和女性卵泡液中INH-B的存在形式及其理化特性的相关研究基本上是空白。由于受到材料的限制，以往对于INH-B纯化方法的研究，多取材于动物，如猪卵泡液9等。本实验则使用人卵泡液为实验材料，利用INH-B本身的生化 性质，通过乙腈富集、阴离子交换柱分离、等电点分离的三步分离法;,初步纯化获得人体卵泡液中天然INH-B蛋白分子粗制品，纯化回收率达38.70%,并准确鉴定出其在人体中的等电点为4.55左右，为近一步研究人体INH-B的功能和结构特征打下基础，可能为临床诊断产 品的开发提供了新的思 路 和 理 论依据。