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1、,淋巴瘤基因克隆性重排和IGHV体细胞超突变检测,辅助诊断,预后分析,指导用药,MRD检测,血液肿瘤（常规肿瘤）检测方案-MICM综合分子检测(旌准方案),Moffitt, A. B. and S. S. Dave (2017). J Clin Oncol 35(9): 955-962.,分子检测-淋巴瘤,最丰富的阳性对照,5,BIOMED-2唯一授权的商品化试剂,1,全面涵盖各种TB细胞重排类型,可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的“金标准”,超过400例的临床样本验证，反应体系稳定，结果可靠,3,2,4,淋巴细胞克隆性基因重排检测产品特点,B-Cell Receptors (BCR) /Im
2、munoglobulins (Ig),T-Cell Receptor (TCR),淋巴细胞克隆性基因重排检测的目标分子Ig和TCR-单一基因重排，即恶性淋巴细胞,IGH, TRB & TRD: V, D, and J IGK, IGL, and TRG: V and J regions,正常淋巴细胞成熟过程/良性病变,多克隆性,多种形式的基因重排,恶性淋巴瘤发生的过程,单克隆性,突出单一形式的基因重排,多样性与克隆性,鉴别诊断：明确是淋巴组织反应性还是淋巴细胞恶性增殖 辅助诊断：少见类型淋巴瘤，如肝脾T细胞淋巴瘤 亚类分析：明确是B淋巴恶性增殖还是T细胞恶性增殖 区分同一患者两种淋巴细胞恶性肿
3、瘤，包括复发与继发淋巴瘤 微小残留病灶监测，评估治疗效果或复发风险（NGS方法） 细胞免疫治疗监测，监测回输T细胞增殖状况和淋巴组织来源肿瘤细胞清除效果（NGS）,5%15%的病例表现复杂，即使做了大量的免疫标志也可能难以鉴别其良恶性，需要进一步的手段区分。 利用分子生物学手段分析Ig和TCR基因的克隆性重排被WHO公认为该疾病诊断手段的重要补充。,淋巴细胞克隆性基因重排检测的临床意义,基于PCR检测技术，简便、快速、成本较低，所需DNA量少，对DNA质量要求不高。灵敏度高于10%，需配制胶，安全清洁性较差。,基于PCR-毛细管电泳检测技术，敏感性高，检测周期较长，结果更加直观可靠 目前市场最
4、被接受的检测方法。灵敏度无法满足MRD要求，难以定量和得到序列。,新兴技术，更高灵敏度（10-6），更高分辨率，更高的通量，更广泛的应用。但成本高，仪器贵，操作复杂，时间长。,（IGH, IGK,）（IGL）（TRB ,TRD,）（ TRG）BIOMED-2方案，唯一授权） IGHV（依据ERIC指南）,IGH, IGK, TRB , TRG IGHV,基于不同方法的产品系列-Invivoscribe公司,Invivoscribe公司的IdentiCloneTM系列产品是基于PCR的克隆性检测产品，是BIOMED-2唯一授权的商品化试剂，获得CE认证，以其高度的灵敏性和特异性，成为可疑淋巴组织
5、增生性疾病克隆性分析的“金标准”。 IdentiCloneTM系列产品具有精心优化的标准化试剂组成，具有最丰富的阳性对照，涵盖各种TB细胞重排类型，经过了超过400例的临床样本验证，按照临床产品的标准进行质检和质控，反应体系稳定，结果可靠。,从Biomed-2到Invivoscribe-唯一授权,Biomed-2研究项目,Biomed-2研究项目（IGH为例）,van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 17: 2257.,Biomed-2研究项目（IGH为例）,van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leuke
6、mia 17: 2257.,结果分析,（单）克隆性：扩增产物电泳在预期大小范围内一或双条带（峰） 送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的重排方式为单一性。表明组织中存在单克隆性增生的细胞群。 多克隆性：扩增产物电泳呈弥散涂抹状(smear)或阶梯状(高斯分布） 送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的重排方式为多样性。表明组织中不存在单克隆性增生的细胞群。 无扩增产物：PCR扩增后电泳未见产物 送检组织中的细胞，抗原受体基因无重排（NK，非淋巴细胞）或DNA质量过差。,淋巴瘤应用基因重排检测进行辅助/鉴别诊断的方案,检测到克隆性重排未必一定发生恶性病变 某些良性增生也可呈克隆性重排，如CD8+T细胞淋巴
7、增生性病变、良性单克隆性丙种球蛋白病、皮肤淋巴瘤样丘疹病、免疫缺陷患者严重的EB病毒感染等； 检测不到克隆性重排也不能排除恶性病变 某些明确恶性病变的免疫缺陷患者中偶尔检测不到克隆性重排，NK/T细胞淋巴瘤中IG和TCR基因呈胚系结构，即也无克隆性重排。 IG或TCR基因的重排不一定是谱系的标志 特别是大多数前驱淋巴细胞性肿瘤中存在谱系交叉，如血管免疫母细胞学淋巴瘤（AITL）。单一发生可反映谱系，同时阳性只表示克隆性增生，不能判断谱系来源。 假阳性和假阴性 技术，引物，反应条件 分子克隆性结果分析，应结合临床、形态学和免疫表型特征，方可做出淋巴瘤的最终诊断和分类。,注意事项,对以下疾病提供重
8、要预后信息:慢性淋巴细胞白血病(CLL) 前提： IGH克隆性重排为单克隆 例外： V3-21重排区表达与预后不良相关，与IGHV突变状态无关。,SHM 判断标准：,IGH V区的SHM状态检测被推荐为新诊断CLL患者预后分析的生物标志物。,PFS：无进展生存期（Progression free survival） OS：总生存期（Overall survival）,中国CLL/SLL的诊断与治疗指南（2018版）,IGH V区体细胞超突变检测的临床意义,基于PCR检测技术，简便、快速、成本较低，所需DNA量少，对DNA质量要求不高。灵敏度高于10%，需配制胶，安全清洁性较差。,基于PCR-毛
9、细管电泳检测技术，敏感性高，检测周期较长，结果更加直观可靠 目前市场最被接受的检测方法。灵敏度无法满足MRD要求，难以定量和得到序列。,新兴技术，更高灵敏度（10-6），更高分辨率，更高的通量，更广泛的应用。但成本高，仪器贵，操作复杂，时间长。,IGH, IGK, IGL, TRB ,TRD, TRG（BIOMED-2方案，唯一授权） IGHV（依据ERIC指南）,IGH, IGK, TRB , TRG IGHV,基于不同方法的产品系列-Invivoscribe,结合 Leader 和 FR1 区域的引物在 5端连接有通用的测序片段，这种设计，配合 JH 反向测序引物，能够实现 PCR 扩增产物的双向测序。目前，欧洲慢性淋巴细胞性白血病研究机构（European Research Initiative on CLL，ERIC）的指南即使用双向测序判断 IGH V区体细胞超突变（Somatic Hypermutation， SHM）状态。,IGHV SHM的检测,淋巴瘤51基因突变NGS检测,淋巴瘤51基因突变NGS检测,A,C,D,B,产品特点,谢谢大家！,