《甲胎蛋白基因的检测.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《甲胎蛋白基因的检测.ppt（16页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、甲胎蛋白基因的检测 outline 实 验 目的 方法 与原 理 设 计 路 线 可能 的 结 果分 析 应 用 实验目的 目的：通过提取肝癌病人的外周血，根据 mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（ 甲胎蛋白）基因的表达进行检测。 取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌 性肝病患者作为对照组。 实验方法及原理 通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成 cDNA，利用qPCR技术，测定AFPmRNA的丰 度。 实时荧实时荧 光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR） 是一种在DNA扩扩增反应应中，以荧荧光化学物质测质测 每次聚合 酶链链式反应应（PCR）循环环后
2、产产物总总量的方法。 Real-timePCR是在PCR扩扩增过过程中，通过荧过荧 光信号， 对对PCR进进程进进行实时检测实时检测 。由于在PCR扩扩增的指数时时 期，模板的Ct值值和该该模板的起始拷贝贝数存在线线性关系， 通过过内参或者外参法可对对待测样测样 品中的特定DNA序列进进 行定量分析。 技术路线 提取RNA 琼脂糖凝胶 电泳 cDNA合成 qPCR检测统计 学处理 RNA提取 用TRIzol试剂盒提取RNA TRIzol是一种新型总RNA抽提试 剂，可以直接从细胞或组织中提 取总RNA。其含有苯酚、异硫氰 酸胍等物质，能迅速破碎细胞并 抑制细胞释放出的核酸酶。 RNA提取 1.
3、细胞或组织加 Trizol后，室温放置5min， 使其充分裂解。注：此时可放入-70长期保 持。 2.12,000rpm离心5min，弃沉淀。 3.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混 匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器， 以免基因组DNA断裂。 4.412,000rpm离心15min。 5.吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万 不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质 ，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA， 则弃下层酚相。 带带手套是必须须的， 手是RNase的主要 来源！ RNA提取 6.按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀， 室温放置5-1
4、0min。 7.412,000rpm离心10min，弃上清，RNA 沉于管底。 8.按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温 和振荡离心管，悬浮沉淀。 9.4 8,000rpm离心5min，尽量弃上清。 10.室温晾干或真空干燥5-10min。RNA样品不 要过于干燥，否则很难溶解。 11.可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶 解RNA样品，55-60,5-10min。 RNA提取 12.将提取的RNA于紫外分光光度计上定量测OD 值定量RNA浓度 注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之 间（组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用
5、量； 组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染 ） 13.于0.8%琼脂糖凝胶电泳以明确RNA未降解。 cDNA合成 cDNA合成使用Promega逆转录试剂盒 反应管中加入1ug总RNA和0.5ug oligodT,70预变性 5min,迅速置冰上冷却 加入5RTbuffer250mM Tris-HCL(PH8.3),375mM KCl,15mM MgCl2,50mM DTT4ul,10mM dNT1ul,RNA酶 抑制剂25U,M-MLV逆转录酶200U,加0.1%DEPC水至总体积 20ul,37水浴60min 953min灭活逆转录酶,-20冻存备用。 RT-PCR 上游引物序列
6、: 5-TGGGACCCGAACTTTCCAAG-3 下游引物序列: 5-CCTGCAGACAATCCAGCACAT-3 探针序列： 5-TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT-3 RT-PCR 50ul PCR反应体系中,包括5PCR buffer 10ul,AFP 上下游引物各16pmol,荧光探针10pmol,Tag酶 3U,10mM dNTP1ul,cDNA 5ul 在ABIPRISM7700型PCR仪(美国PE公司)进行扩增。 反应条件:93预变性2min,9345s,55120s,共 40个循环。反应结束后由计算机自动得出每ug总RNA 中AFP mRNA的拷贝数。 统计
7、学处理 统计学处理进行t检验,以p0.05为显著统计学 差异。 可能的结果分析 肝癌患者与对照组的外周血中AFPmRNA的表 达水平有显著差异。 应用 AFPmRNA由有活性的肝癌细胞表达,坏死后脱落入 血的肝癌细胞不可能有mRNA的表达,即使肝脏癌 组织直接释放少量裸露的AFPmRNA,也会被血液 中丰富的RNA酶所迅速降解,外周血中检出 AFPmRNA即提示血循环中存在活动的肝癌细 胞。 检测肝癌细胞的扩散水平，辅助影像学和病理学检 查。 参考文献 1NIEChang-fu,WANGJian-Guo,YANGRui-min.The Detection of AFP mRNA expression in PeriPheral Blood of Patients with Hepotocellular Careinomal Using Real Time RT-PCR Method. Chinese Journal of Misdiagnosties, November2013,Vol.3 No.11