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1、BCR-ABL,上海睿昂 技术部,主要内容,典型BCR-ABL融合基因检测 不典型BCR-ABL融合基因检测 ABL激酶区耐药检测 相关检测产品,典型BCR-ABL融合基因检测,背景知识,t（9;22）(q34; q 11)易位形成 存在于95%的慢性髓细胞白血病(CML)，20%-30%的成人急性淋巴细胞白血病(ALL)和2%-5%的儿童 ALL 患者中。,根据BCR基因的断裂点不同，可分为m-BCR（p190），M-BCR(p210)，u-BCR(p230)三种。 在30-50%的成人ph+的ALL，20-30%儿童ph+的ALL病例中BCR/ABL融合基因是p210型的。 60%的ph+
2、的ALL患者的BCR-ABL融合基因是p190型的 。 其中P230融合基因非常罕见。 p190刺激细胞增殖的能力比p210要强，病情发展快、恶性程度更高，,BCR-ABL,BCR-ABL,在ALL中，Ph阳性和随之出现的BCR/ABL融合基因是一个非常不好的标志，它影响着病人血相的完全缓解率和可能的生成率。 该基因阳性的病人，可用格列卫(TKI)进行治疗。 但是BCR-ABL阳性的ALL患者预后差，5年存活率20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗。,注： IS(国际标准化) Ph（ 费城染色体 ） TKI（酪氨酸激酶抑制剂）,初诊CML时需做BCR-ABL基因检测进行确诊（Ph),慢
3、性髓系白血病(CML)慢性期患者的诊断及初始治疗示意图,伊马替尼 400 mg 每日1次 尼洛替尼 300 mg BID 达沙替尼 100 mg 每日1次,注： IS(国际标准化) Ph（ 费城染色体 ） TKI（酪氨酸激酶抑制剂）,治疗3个月后BCR-ABL定量检测对诊疗方案选择十分重要,注： PCyR(部分细胞遗传学反应) CCyR(完全细胞遗传学反应),NCCN推荐CML跟踪治疗监测标准,CML-如何进行相关实验室检测,QPCR检测： 1,在诊断时; 2, 当患者对治疗有反应时,每三个月检测一次; 达到CCyR后，3年时间里每三个月检测一次， 之后每3-6个月检测一次； 3，若发现在MM
4、R阶段, BCR-ABL上升（1 Log），应在1-3个月内重复QPCR检测.,CML分子学缓解的评估标准,BCR-ABL融合基因定量的意义,1、对BCR-ABL融合基因的检测不仅可以对该类病人进行确诊，而且可以根据定量的结果制定合适的治疗方案 2、在治疗过程中，根据融合基因的定量情况，对疗效进行评价和预后判断 3、在达临床缓解后，对融合基因进行定量检测还可以对复发进行预测，从而确定干预性治疗的时间，剂量等，使病人获得一个长的无病生存期,不典型BCR-ABL融合基因检测,不典型BCR-ABL融合基因,除了三类典型的BCR-ABL融合基因外，约有1%的CML患者其断裂点不在以上常见的位点，从而形
5、成不典型BCR-ABL融合基因亚型，包括e3a2、e6a2、e8a2、e13a2、e19a2、e14a3、e1a3、e13a3等。 由于BCR-ABL常规检测类型中并不包括少见的不典型BCR-ABL融合基因亚型，因此容易导致PCR检测结果的假阴性，延误该类病人的诊断和治疗。,e6a2,来源：Acta Haematol. 2009.7.29;122(1):11-16. Epub ahead of print Links,具有bcr-abl罕见断裂点e6a2的2位病人伊马替尼无效,e1a3,测序结果：,采用VCP化疗方案联合伊马替尼治疗1个月后，BCR-ABL融合基因转阴，进一步证实e1a3对TK
6、I敏感。,e14a3和e19a2,伴不典型BCR-ABL融合基因的CML发病率极低，酪氨酸及酶抑制剂或HSCT都可以取得疗效。,实例分析：e13a3,4例标本验证： FISH检测阳性，但是筛查或BCR-ABL荧光定量检测结果阴性。 不典型BCR-ABL融合基因荧光验证结果：e13a3,不典型BCR-ABL荧光检测结果（标本验证）,20,全基因组测序发现新的融合方式：e13a2,Detection and characterization of a novel BCR-ABL1 fusion in chronic myeloid leukemia by next-generation seque
7、ncing,这个初诊为CML，染色体核型分析未见分裂像，所有BCR-ABL1检测都是阴性. 经NGS WGS检测，发现一个新的BCR-ABL1融合基因(e13a2).,CML案例, 细胞遗传学分析和FISH检测结果费城易位， 而BCR-ABL1检测是阴性。 经NGS WGS检测，发现一个新的BCR-ABL1融合基因(e14a3).,全基因组测序发现新的融合方式：e14a3,Lyu et al. Molecular Cytogenetics (2016) 9:47 DOI 10.1186/s13039-016-0257-5,A novel BCR-ABL1 fusion gene and its
8、 transcript in a CML case.,ABL激酶区耐药检测,背景知识,近年来出现的靶向治疗药物，酪氨酸激酶抑制剂 ( tyrosine kinase inhibitors，TKIs) 因药物安全系数高，且服用方便，对患者生活质量影响小，被广泛应用于临床治疗 CML。其中 伊马替尼逐渐取代传统治疗方法，成为CML的一线治疗方案。 随着伊马替尼广泛应用于临床，部分患者在服药过程中失去了对于伊马替尼的有效反应，或出现疾病进展，研究发现是ABL激酶区突变导致，因此早期发现BCR-ABL突变，监测疾病进展和伊马替尼反应情况，对于疾病诊疗至关重要。,ABL激酶区突变种类,伊马替尼耐药机制中
9、，主要是BCR-ABL点突变，超过 90%，可分为4 类 ： 在 ATP 结合位点形成突变( P-loop) 、 发生于激活环，阻止形成伊马替尼结合所需的构象激酶 发生于催化区 直接损害伊马替尼结合,NCCN推荐BCR-ABL激酶突变分析的检测规范,2012年欧洲肿瘤内科学会（ESMO 2012）TKI治疗慢性髓性白血病慢性期疗效标准,Novartis Oncology Italia,dd: Y253H, E255K/V, F359V/C/I 使用达沙替尼 ee: F317L/V/I/C, T315A V299L 使用尼洛替尼 ff: E255K/V, F317L/V/I/C, F359V/C
10、/I,T315A, Y253H 使用Bosutinib gg: T315I 使用普纳替尼,不同的耐药位点-不同的二代药物,X针对Y253H，E255K/V，F359V/C/I突变患者 Y针对F317L/V/I/C, T315A, V299L突变患者 Z针对E255K/V，F317L/V/I/C, F359V/C/I, T315A ,Y253H突变患者 q针对T315I突变患者或使用2种或以上TKI治疗无效的患者 D2种或以上TKI治疗耐药的患者,不同突变对各种药物耐药的敏感性,来源于长期伊马替尼疗效研究项目（Long-Term Imatinib Effects，ILTE）,Haematolog
11、ica 2016 Volume 101(7):830-838,Ultra-deep sequencing leads to earlier and more sensitive detection of the tyrosine kinase inhibitor resistance mutation T315I in chronic myeloid leukemia,二代测序能更早的监测到T315I的突变,The T315I mutation mediates resistance to imatinib, dasatinib, nilotinib and bosutinib, wherea
12、s sensitivity to ponatinib remains. T315I mutations could be detected earlier by ultra-deep sequencing compared to Sanger sequencing in a selected group of cases. Earlier mutation detection by ultra-deep sequencing might allow treatment to be changed before clonal increase of cells with the T315I mu
13、tation.,相关检测产品,相关产品目录,样本准备,样本类型：首选骨髓标本。初发病人可使用外周血抗凝标本 (EDTA抗凝管) 样本采集要求： (1)监测MRD时，保证骨髓细胞数量达到106 cells/ml (2)样本不纯或数量少：采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞 样本运输： (1) 常温运输：保存在Qiagen商用柱或RNALader中 (2) 4度运输: 保存在3倍体积的Trizol， 4度运输1周后，放置-20度保存后，可反复冻融10次。 样本处理：处理样本器材要一次性，避免交叉污染 样本保存：-20度-80度保存 样本提取：Qiagen公司 的Rneasy Mini kit试剂盒、经典的RNA抽提方法是Trizol法，可同时获得RNA和DNA样本。,实验步骤,UNG酶防污染体系,不典型BCR-ABL融合基因检测产品,ABL激酶区突变检测产品,Thank you ！,