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1、主动载药法制备硫酸卷曲霉素脂质体及其质量评价【摘要】目的制备硫酸卷曲霉素脂质体，建立含量和包封率的测定方法，初步考察其体外释放规律。方法采用pH梯度法制备硫酸卷曲霉素脂质体，超滤法分离脂质体与游离药物，RPHPLC测定脂质体的含量和包封率，透析法考察脂质体的体外释放行为。结果超滤法能很好地将脂质体与游离药物分离，测定硫酸卷曲霉素脂质体的含量为/ml，包封率为%，脂质体的体外释放规律符合一级动力学过程。结论pH梯度法适于制备硫酸卷曲霉素脂质体，超滤法可用于硫酸卷曲蜮霉素脂质体包封率的测定，制备的脂质体威具有一定的缓释效果。【关键词】硫炖酸卷曲霉素；脂质体；pH梯度法；包封率；体外释放ABSTRA
2、CTObjectiveTopreparecapreomycinsulfateliposomestodevelopa琳methodfordetermini髀ngitsdrugcontentandentrapmentefficie颃ncyandtostudythere搭leaseprofileinvitr懦o.MethodsCapreom际ycinsulfatewasenca邬psulatedintothelip逐osomesusingthepHgr陵adientdependentrem亮oteloadingtechniqu蝗e.Freecapreomycins痊ulfateandliposome
3、s岂wereseparatedbyult雀rafiltration,RPHP瘦LCwasappliedtodete出rminetheentrapment殂efficiencyanddialysiswasutilizedtost衮udythereleasebehav趟iorofdrugfromlipos蓓omeinFreecapreomy窳cinsulfateandlipos宪omeswaswellseparatedbyultrafiltratio畲n.Thecontentandent垦rapmentefficiencyo肛fcapreomycinsulfat卷eliposomesdetermi
4、n觌edwere/mland%respe吻ctively.Therelease徐profileinvitrowass桀ubjectedtothefirst少ordermodel.Conclu蒽sionThepHgradient蛳techniqueissuitableforpreparingcapre瞥omycinsulfatelipos绞omeswhichexhibitss犹ustainedreleasepr诹ofileinvitro.Ultra舞filtrationestablis踝hedinthisstudycanb壳eappliedinthedeter能minationofentrapm
5、e贵ntefficiencyofcapr不eomycinsulfateliposomes.KEYWORDSCa憾preomycinsulfate;L鸽iposome;pHgradient烃s;Entrapmenteffici瑚ency;invitroreleas娱e硫酸卷曲霉素(capreomyc掘insulfate，CS)是一种对结核分枝杆菌有效的抗生素，结构式如。由梓于其对链霉素、卡那霉素耐药的肺结核患粗者仍有效，因而在抗结核治疗中具有重要价值，常作为二线抗结核药1。目前，CS的临床使用剂型多为肌肉注射和静洋脉滴注。肌肉注射由于局部硬结、疼痛等知不良反应，患者无法耐受，致使用药中断，治疗失
6、败。CS的不良反应主要为耳毒励性和肾毒性，因此有必要利用合理的给药别系统，降低其毒副作用，提高临床疗效。脂质体作为一种安全有效的药物载体，通镘过与细胞膜发生融合和作用提高治疗效果麽。已有多种抗生素药物制成脂质体药物传得递系统，取得了较好的疗效2。脂质璃体对水溶性药物包封率不高，采用薄膜分尺散法制备CS脂质体，包封率仅达13%蠡3。本实验进行了主动载药法制备C搽S脂质体，以期获得较高的包封率。屑1仪器与试药Thestructur坛eformulaofcapreomy骟cin岛津高效液相色谱仪(LC1摞0AT泵，SPD10A紫外检测器，驻NXX工作站)，超声波细胞粉碎机(宁院波新芝科技研究所)，旋
7、转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)，超滤器(50K，P张ALLCorporation，USA仃)。CS原料药(华北制药华胜有限公抚司)，CS对照品(中国药品生物制品检迥定所)，大豆磷脂S100(上海东尚实咏业有限公司)，胆固醇(天津市博迪化工肮有限公司)，TritonX100(涩北京化学试剂公司)，甲醇、乙腈(色谱恹纯，天津康科德科技有限公司)，其余试擎剂为分析纯。2方法与结果C骁S脂质体的制备4(1)空白脂质体的制备称取处方量的脂质材料，置于舐圆底烧瓶中，用适量无水乙醇溶解，减压篦蒸发，得磷脂膜。加入300mmol/倒L柠檬酸溶液()水化，经探头超声处理炳后依次通过和m的微孔滤膜，即得空白脂质体
8、混悬液。(2)空白脂质体的载佰药吸取上述空白脂质体1ml，加入适量CS溶液，并用Na2HPO4溶液(蘩1mol/L)调节外相pH值至近中性，置37水浴中孵化20min，即得鹭CS脂质体。CS含量分析方法的建耪立(1)色谱条件色谱柱：ODSC18柱(250mm，5m，Dia浚monsil)，流动相：/L己烷磺酸钠溶液甲醇乙腈冰乙酸(6025252)，检测波长254nm，谴流速/min。(2)标准曲线绘制怍精密称取CS原料药适量，用流动相溶解馑配成浓度约为/ml储备液，精密移取一定量的储备液，用流动相配成浓度为16槎、32、64、96和112g/ml琨的溶液，进样20l记录色谱图。以峰漏面积A为纵
9、坐标，以浓度C(g/ml腌)为横坐标，得回归方程：A=32683C-61550r=表明在16112g/ml范围内CS浓度与峰麋面积呈良好的线性关系。(3)专属性僧实验精密量取空白脂质体和含药脂质体狺2ml，用适量5%tritonX1槟00的乙醇溶液破坏后，用流动相稀释至噗适当浓度，分别进样20l，记录色谱酋图()。精密移取一定量的储备液，用流动相配成适当浓度的CS溶液，进样2返0l，记录色谱图，为CS对照品色谱拦图()。(4)精密度实验分别取高哔、中、低3个浓度的CS溶液，同一天内眄重复测定5次，计算日内精密度，RSD朐分别为%、%和%；连续测定5d，计算淬日间精密度，RSD分别为%、%和%。
10、(5)回收率实验精密量取1ml空白丢脂质体混悬液，分别加入至、和CS储备跑液(/ml)中，用适量5%Trito某nX100的乙醇溶液破坏后，用流动相定容至10ml，分别进样20l，郢记录峰面积，计算回收率，分别为%、%外和%。CS脂质体总药量的测定精兆密量取脂质体2ml，用5%Trito孙nX100的乙醇溶液破坏后，取适量昀上述溶液于10ml容量瓶中，加1:娣CapreomycinsulfateI;2:CapreomycinsulfateIIThechromat瘿ogramsofblanklipos钎omes(A),references抨olution(B)andCSlip限osomes(C)
11、流动相溶解并稀释至刻度，进样20l，测定峰面积；另取橹CS原料药适量，流动相溶解并稀释成1撩0mg/ml溶液，按“标准曲线绘制”罩项下方法测定，用外标法计算供试品中C弧S的含量。测得三批样品含量分别为、和/ml。超滤法测定CS脂质体的包低封率方法回收率的考察精密配制高、弁中、低3个浓度(相当于CS浓度为11撸2、64和16g/ml)的药物溶液丈，分别取适量至超滤器中进行超滤，弃去铽初滤液，收集续滤液，用高效液相色谱法郎测定药物含量(W)，测定超滤前溶液中盒药物的含量(W0)。用公式W/W0夸100%计算回收率，分别为%、%和%煦。精密量取CS储备液适量，加至空白芯脂质体中，使CS浓度分别为11
12、2、6鱼4和16g/ml，分别取该溶液适量猖至超滤器中进行超滤，弃去初滤液，收集耜续滤液，用高效液相色谱法测定药物含量斩，计算加样回收率，分别为%、%和%。贿包封率的测定将适量的CS脂质体置于超滤杯中，密封后氮气加压，弃去初滤盾液，收集续滤液。以流动相稀释定容后进样，计算游离药物含量(W)；精密量取癔CS脂质体1ml，用适量5%Trit恙onX100的乙醇溶液破坏后，用流馔动相稀释定容至适当浓度进样分析，计算酬脂质体中药物总含量(W0)，包封率的计算公式为：W/W0100%。测得报三批样品的包封率分别为%、%和%(n=3)。CS脂质体的体外释放行为精密移取载药脂质体2ml，置于透析袋琦内，扎牢
13、两端，置于溶出仪小蓝中。释放崧条件：的PBS150ml，37，5痿0r/min。定时取样5ml，同时补充相同体积的介质。高效液相法测定，以苣外标法计算累积释放量，同时取药物PB骂S溶液剂2ml于透析袋内作为对比()。由可见，脂质体中药物的释放有明显的粢缓释效果。分别通过零级动力学、一级动唬力学、Higuchi方程对体外释放曲骶线进行拟合()，结果显示药物的释放符蟮合一级动力学方程。3讨论硫酸卷改曲霉素为水溶性药物，为了得到较高的包襦封率，本实验采用pH梯度法。根据He赙ndersonHasselbalc赖h理论，每个pH单位的变化会产生分子涞型与离子型药物浓度10倍之差。如果脂髯质体内外pH梯
14、度为个单位时，理论上就会造成药物分子型与离子型浓度的1000倍之差。由于分子型药物易与脂质体双分子膜结合，加之在高于膜相变温度孵化抗时，脂质体由“胶晶”态变为“液晶”态谬，膜的通透性大为增加，从而加快了药物抵分子的跨膜内转过程,提高了水溶性药物削的包封率。因此，内外水相pH值，孵化粹温度和时间都是影响脂质体包封率的重要掖因素。孵化温度一般要高于相变温度，膜潍的通透性增加，加快了药物分子的跨膜内乱转过程，孵化时间不得太长，否则会导致官药物分子泄露，反而降低了包封率。脂赤质体包封率的测定方法主要有：透析法、甾葡聚糖凝胶过滤法、超速离心法和超滤法迮。透析法时间较长，并且过程中会导致包芬封在脂质体中的
15、药物泄露，因此所测得包悯封率偏低；葡聚糖凝胶过滤法预处理较为縻繁琐，并且可能由于对乳光判断不准确使行测得的包封率有误差；超速离心法操作费缴时且能源消耗较大；而超滤法简便快速，擂适合测定水溶性药物的包封率。脂质体在卜体外释放过程中表现出两个释放相。0内表现为快速释放相，大约释放总药量的篆40%左右。这可能是未包封入脂质体的戆游离药物的释放，测得脂质体的包封率约嘧为47%证明存在40%的游离药物。而12h则表现为药物的缓慢释放，这是蝻因为脂质体内相的药物要跨越脂质双层才膂能进入释放介质，脂质体对内相药物的释僚放起到了缓释作用。本实验制备的硫酸迮卷曲霉素脂质体的包封率可达到47%，愧远没有达到中国药
16、典(XX版)附录对脂缕质体包封率的要求，如何进一步提高其包样封率，仍有待研究。【参考文献】1崔春英，杨淑先，赵长生，等.静醢脉注射用硫酸卷曲霉素长期稳定性试验研怜究J.中国药品标准，XX，4(3虫)：5051.2OhYK,N沮ixDE,StraubingerRM雕.Formulationandefficacyofliposomeenc虾apsulatedantibioti辁csfortherapyofintr昏acellularJ.Antim达icrobAgentsChemoth皑er,1995,39(9):2104乍2111.3Giovagno搡liS,BlasiP,Vescovi藏C,etal.Unilamellarvesiclesaspotentia鼬lcapreomycinsulfatecarriers:Preparat瑷ionandphysicochemi谶calcharacterizatio毪nJ.AAPSPharmSciT钔ech,XX,4(4):112.9 / 9