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1、第六章：有丝分裂纺锤体的组装,第一节 有丝分裂纺锤体,一、有丝分裂纺锤体的结构与行为,微管： 动粒微管 极间微管 星体微管 极体：有中心体or无 染色体：在动粒处与微管附着,间期细胞的微管长而稳定，而有丝分裂期的微管特性发生很大变化，如微管越来越短，并能快速生长收缩。这些行为对于微管对动粒以及其他纺锤体成分的搜索与捕捉十分理想,一、有丝分裂纺锤体的结构与行为,微管必须双极阵列 纺锤体上染色单体对指向必须正确 每个姊妹染色单体必须连接到相反的纺锤体极,有丝分裂纺锤体必须是双极,纺锤体结构和染色体附着的两侧对称，对于纺锤体拉开染色单体对，以及将一套完整的染色体转运到细胞任一极的能力非常重要,二、纺
2、锤体的组装,如何构建围绕姊妹染色单体的微管双极阵列； 以及如何将姊妹染色单体以正确的双指向性附着于双极阵列上。 所有的真核生物中，两极纺锤体的构建很大程度上依赖于纺锤体成分的自我组织能力。 马达蛋白分子和其他蛋白与微管相互作用，将它们组织成每一列微管的正极在中心重叠的反向平行阵列,第二节 微管的核化，稳定性和运动性,一、g-TuRC,g-微管蛋白指环复合物（g-TuRC）：大的蛋白复合物，含有称为g-微管蛋白的特化形式的微管蛋白，它能将微管在其负极核化，允许正极向外生长。 微管组织中心：中心体和纺锤体极体， g-TuRC附着其上,二、稳定与去稳定蛋白,微管的动态特性：生长速率，微管解聚频率,二
3、、稳定与去稳定蛋白,解聚因子：驱动蛋白-13家族，结合于微管末端，通过启动构型变化破坏原纤丝之间的横向作用来诱导微管的解聚 。 稳定蛋白：蛙的XMAP215蛋白，对抗解聚因子的去稳定效应。结合在微管的侧面或端部。其作用部分是通过结合到微管正极，并因此阻断其与去稳定子的结合来实现,二、稳定与去稳定蛋白,数个重要的蛋白质结合到微管正极并控制正极的动态变化，或将正极连接到其他细胞结构。 这一家族中的一个突出成员是EB1，它能结合到正在生长而不是收缩的微管的正极，与动粒和细胞皮层处的一些其他蛋白相互作用。 另一群重要的微管调节蛋白稳定并交联微管的负极以形成集中的纺锤体极，这通常在一些马达蛋白的辅助下进
4、行，这些马达蛋白能沿着微管朝负极方向运动。,三、马达蛋白,沿着微管移动，运输分子货物 将微管连接成产生拉力的阵列如纺锤体。 两类微管马达蛋白家族： 驱动蛋白（Kinesin）或驱动蛋白相关蛋白的大家族，在真核生物中含有很多成员，大部分驱动蛋白相关马达蛋白分子沿着微管朝正极移动，尽管有些也朝反方向运动。 动力蛋白（dynein）：都朝着负极移动。,四种类型的主要马达蛋白在纺锤体组装中特别重要： 驱动蛋白-5：两个马达蛋白结构域结合不同的微管，交联反向平行的微管：分离两极 驱动蛋白-14蛋白：负极指向，交联微管，将他们相互滑动或集中于纺锤体极处 驱动蛋白-4和驱动蛋白-10蛋白：负极指向，与染色体
5、臂相结合：拉动染色体 细胞质动力蛋白：负极指向，能在细胞内不同位置将微管与其他蛋白交联：如皮层,第三节 中心体和纺锤体极体及其复制,一、中心体和纺锤体极体,中心体,The G1G2 tether,The SM Linker,Appendage,PCM,中心体周期,一、中心体和纺锤体极体,芽殖酵母纺锤体极体与动物细胞中心体几乎没什么相同之处。它由一垛蛋白片层结构组成，称为板层，插入核被膜内。 内板 外板 中板 核化新纺锤体极体的组装,二、中心体和纺锤体极体的复制,？控制？ 发生时间：在G1期末段 控制因素：G1/S-Cdks；S期周期蛋白 A-Cdk2复合物也可协助启动复制过程。 How? 动物
6、细胞：磷酸化称为nucleophosmin和CP110的两个中心体蛋白发挥作用。 芽殖酵母中：磷酸化包括称为Spc42的核心成分是数个蛋白质,二、中心体和纺锤体极体的复制,其他调节因素： Plk4的蛋白激酶，是Polo-like蛋白激酶家族的一个远缘成员 Zyg-1的激酶，能启动线虫胚胎中心粒的合成。 泛素介导的蛋白酶解，包括泛素-蛋白连接酶SCF，也有助于中心体复制的启动。,三、中心体复制在一个细胞周期中一般只发生一次,机制了解很少。很大的一个可能性是中心体复制与染色体复制的调控机制相同： 即，当S期发生中心体复制时，存在某种机制来阻断其再次复制，并且这种阻断直到细胞完成周期进入下一个G1期
7、后才解除。,第四节 动粒,一、动粒是微管染色体附着的主要位点,动粒位于染色单体的着丝粒处，将着丝粒与纺锤体极体发射出的微管的正极连接。 附着位点， 监控局部拉力与微管附着，并发出信息改变自身行为并控制细胞周期进程：spindle checkpoint 产生或控制纺锤体上拉动染色体的拉力：马达蛋白分子和其他微管结合蛋白,二、动粒为动态的微管正极提供了稳定的附着,微管附着在动粒上的一个有趣的特征是当牢固附着时，微管正极仍然可以生长与收缩，使得染色体可以在纺锤体上前后移动，并使微管蛋白亚单位能在微管流中添加到正极。 动粒与一滑动的轴或环相连，后者环绕于微管的近顶端处将微管正极暴露在外，因此微管蛋白二
8、聚体可丢失或添加。,二、动粒为动态的微管正极提供了稳定的附着,在体外，纯化的十亚基Dam1复合物相互结合形成大的12-16个复合物的集合体。电子显微镜提供强有力的证据表明，他们组装能形成围绕微管的指环，因此在细胞内它们能作为轴环围住微管正极。 Dam1轴环能够被Ndc80复合物锚定于内侧动粒上 很多与正极相连的蛋白能形成庞大的帽子，可防止微管从环中滑出。当正极发生解聚时，微管原纤维向外的弯曲也能起到同样的作用。,第五节 纺锤体组装的早期步骤,一、中心体的分离起始了纺锤体组装,纺锤体组装的一个关键早期步骤是复制的中心体的分离，这一过程可以分成两个独立的步骤。 第一步是中心体分割(disjucti
9、on)：两个复制的中心体之间的黏连蛋白连接被尚未了解的机制解除。 第二步是中心体分离(separation):不相连的中心体移动分开，负向马达蛋白来完成。,一、中心体的分离起始了纺锤体组装,中心体分离如何受细胞周期调控系统的控制了解得很少。中心体分离的起始依赖于有丝分裂Cdk活性，但驱动这种分离的Cdk靶标尚不清楚。 有丝分裂Cdks和蛋白激酶aurora A对于核被膜崩解后中心体的分离都是必需的，这些激酶的可能靶标是驱动蛋白-5Eg5，它的磷酸化能启动其推开中心体的能力。 C-Nap1是已知的中心体蛋白，在有丝分裂中被称为Nek2的蛋白激酶磷酸化，这种修饰可启动中心体失去黏连，从而起始中心体
10、的分离。,二、中心体成熟增加了有丝分裂微管的核化,在晚前期，中心体表现出微管核化能力的急剧增加，这是纺锤体组装成包装致密的微管阵列的先决条件。 中心体的成熟过程包括将大量新的g-TuRC招募到中心体处。,二、中心体成熟增加了有丝分裂微管的核化,成熟可能受到蛋白激酶Plk的控制，因为显微注射抗该激酶的抗体可以将此过程阻断。 Plk的靶标尚不清楚，但来自果蝇的证据表明，Plk调控了称为Asp的蛋白，后者能将g-TuRCs锚定在中心体上。 中心体成熟也需要aurora A的活性，部分通过将称为TACC的中心体蛋白磷酸化，TACC能帮助将微管负极稳定在纺锤体极体。,第八节 姊妹染色单体对纺锤体的附着,
11、一、中心体在早中期搜索并捕获动粒,有丝分裂纺锤体的组装包括两个主要过程： 第一是围绕染色体的双极微管阵列的组装。 第二是姊妹染色单体对正确地附着在纺锤体相对两极： 搜索与捕获：微管的生长与收缩,一、中心体在早中期搜索并捕获动粒,在前中期早期，大量的微管围攻染色体。一些姊妹染色单体对快速实现双向化并在靠近纺锤体中心处振荡。 中心体发出的微管侧向捕获姊妹染色单体对上的一个动粒，在负极指向的动力蛋白和驱动蛋白-14马达蛋白沿着微管朝向极体一侧快速运送。,一、中心体在早中期搜索并捕获动粒,接近极体处，微管侧向附着转变成标准的顶端附着方向，微管正极插入动粒中。从同一极体来的其他微管也附着到动粒上，形成含
12、有数根微管的动粒纤维。 相反纺锤体极来的微管捕获了尚未被占据的姊妹染色单体对上的动粒，将其拉向纺锤体中心。,一、中心体在早中期搜索并捕获动粒,正极朝向称为CENP-E的马达蛋白驱动蛋白-7继而沿着微管纤维将单向的姊妹染色单体对运送到纺锤体中心，在那儿它被的从反方向极体处来的微管捕获。 正确的双极附着靠更多微管添加到两个动粒纤维来稳定，这样使每根动粒纤维最终含有10-40根微管。,二、动粒与动粒微管,搜索与捕获并不是染色体附着的唯一机制；事实上，该机制在缺乏中心体的细胞中并不十分有效。 另一个附着机制，适用于中心体有或无的情况，依赖于动粒处微管的生长。 中心体发出的微管能捕获成束的动力微管负极，
13、方式与它们捕获动粒一样。,二、动粒与动粒微管,可能靠可溶性的g-微管蛋白指环复合物核化，在接近染色体处形成短的微管，微管被动力蛋白或未附着动粒处的其他蛋白捕获，随后以正极顶端插入动粒。调节蛋白结合了微管正极并启动聚合，使微管向外延伸远离动粒。,三、染色体附着产生姊妹染色单体动粒间的拉力,当姊妹染色单体对正确附着于相反的纺锤体极之后，动粒处向极体的力量以相反方向拉动染色单体，产生了作用在动粒之间的蛋白和DNA结构上的拉力。 着丝粒染色质有着独特的弹性特征，能允许动粒在没有姊妹染色单体黏连的降解时发生一点点的分离。 动粒之间的距离可以反映拉力的大小。动粒的局部分离仅限于染色体动粒附近的一个小的区域
14、，而且不管着丝粒处是否存在丰富的cohesin。,第九节 姊妹染色单体的双指向性,一、动粒-微管附着靠拉力来稳定,单端附着：当染色体附着在早中期开始时，姊妹染色单体对倾向于，如果仅仅是短暂的一瞬间，一个动粒附着于一个纺锤体极，这个状态称为单端附着 两端附着：理想情况下，第二个动粒也附着于相反一极，产生了双指向性或两端附着 同端附着：两个姊妹动粒能附着于相同的纺锤体极 部分端附着：一个动粒附着于两个纺锤体极。 只有而双指向性才能产生动粒间的拉力,拉力越大，越稳定,在纺锤体组装的早期阶段，能发生如此处所示的不稳定的染色体附着。单端附着，尽管不稳定，但却是正确的双极附着的第一步。 附着的强度部分受到
15、动粒拉力的控制。一些不正确附着（同端以及右上方简单的部分端附着）不会产生明显的拉力，因而不稳定，所以微管-动粒结合快速分离。 当实现两端附着时，动粒间的拉力启动微管附着，因此适时锁定了正确的方向。,二、Aurora B对于同端附着的纠正所必需,用抑制中心体分离的药物处理培养的脊椎动物细胞，产生单极的纺锤体，所有姊妹染色单体对同端附着于一个极。然后将药物去除，使附着得以快速纠正并形成如图所示的正常纺锤体。 如果纺锤体的组装是在有抑制Aurora B药物的情况下被触发，结果会产生大部分姊妹染色单体同端附着于一极的双极纺锤体。Aurora B活性因而对于同端附着的纠正是必需的。,二、Aurora B
16、对于同端附着的纠正所必需,Aurora B能去除与动粒的结合后没有拉力的微管。 Aurora B定位在动粒上，能磷酸化很多动粒成分，包括Dam1和Ndc80复合物的亚基。 在缺乏拉力的情况下，Aurora B通过磷酸化微管附着位点的成分，而减少了微管结合的亲和力。 当双指向性产生动粒间的拉力时，这些成分的磷酸化被逆转，附着得以稳定。,第十节 驱动染色体移动的力量,一、动物纺锤体上作用于染色体的三种力量,第一种是由动粒产生的向极力：拉动染色体沿着微管轨道向纺锤体极移动。帮助驱动姊妹染色单体对在中期的振荡，也在后期提供巨大力量以将分离的姊妹染色单体移向纺锤体极。 第二种是由微管流产生向极力：微管轨
17、道在负极解聚，拉动微管轨道自身以及其上所附着的染色单体朝极移动。该力量负责在中期姊妹染色单体间产生巨大拉力，也能在后期帮助分离的姊妹染色单体向极移动。 第三种力量是极排斥力：由非动粒微管产生，能将染色体臂推离纺锤体极。这一力量帮助中期姊妹染色单体对在纺锤体中板处排列，在后期消失。,二、动粒是向极力的主要来源,由动粒产生的大部分向极力并非归因于传统的马达蛋白，而是由于微管正极的解聚。 动粒处解聚中的微管原纤维向外卷曲，推动由Dam1复合物构成的微管轴环。 解聚由MCAK和其他驱动蛋白-13家族成员驱动。,三、微管流产生的向极力,在后期姊妹染色单体分离后，动粒处的解聚与微管流一起产生快速的向极移动
18、。 在非洲爪蟾和果蝇细胞中，微管流速度很快，它对后期染色体的移动具有重要作用。 脊椎动物体细胞和酵母中，微管流相对缓慢或不存在，动粒处正极的解聚是后期向极移动的主要决定因素。,中期中，因为正极的聚合与负极的解聚相同。在动粒处的拉力，主要是由于向极的微管移动受到动粒附着点处摩擦力的阻挡。 在后期开始时，聚合速率下降，产生动力的净移动，速度等于微管流速度减去聚合速度。 动粒微管正极一般在后期转换到解聚状态，然后动粒更快速地向极移动速度等于微管流与解聚速度的总和,四、极排斥力由染色体臂产生,当动粒在中期被拉向纺锤体极时，染色体臂被称为极排斥力或极风的力量推开。当染色体接近纺锤体极时，一些极排斥力简单
19、地来自生长的微管正极构成的致密是障碍物，它们在纺锤体极轨道上向远处推开任何障碍物。 大部分极排斥力由Kid产生，这是驱动蛋白-10家族中的正极朝向的染色体驱动蛋白，能将非动粒微管连接到染色体臂上。 Kid在后期通过被APCcdc20的泛素化而破坏，因而极排斥力被去除并允许分离的姊妹染色单体毫无障碍地地移向纺锤体极。,第十一节 染色体中板集合,一、早中期染色体的振荡,动粒微管一样在两个不同的状态快速切换： 解聚状态，产生向极力，这种状态下两个动粒极向拉动染色单体对； 聚合状态，该状态下微管正极聚合，在动粒处不产生主动的力量。,一、早中期染色体的振荡,当动粒处于解聚状态时，染色单体对向极移动。染色
20、体臂被极排斥力（蓝箭头）推离极，在动粒处产生拉力。 高拉力将动粒转换到聚合或阻碍状态，在这种状态下，不再产生力量，结果被极排斥力推离纺锤体极,一、早中期染色体的振荡,双指向性的姊妹染色单体对也在早中期和中期中呈现出振荡行为。 当动粒在聚合与解聚状态之间转换的时候，产生振荡。而且两个动粒的存在使复杂性增加，即两个姊妹动粒的行为必须在某种程度上保持协调。 当双指向性的姊妹染色单体对向一极移动时，先导的动粒处于产生极向拉力的状态，滞后的动粒通常处于聚合状态，因此动粒受到极向的拉力以及极排斥力背向极体的推力。,一、早中期染色体的振荡,在两个动粒状态之间的转换至少部分受到动粒处微管附着位点拉力水平的控制。 当遇到高度拉力时，动粒倾向于转换到阻碍型的聚合状态，然后当拉力减少时转换到产生向极力的状态。,当双指向性的染色单体对移向一极时，当先导的动粒遇到增加的极排斥力时，动粒转换为聚合状态。滞后的动粒转换为产生向极力的状态，将染色单体朝相反的纺锤体极拉动。 到达相反的纺锤体极时排斥力再次使拉力增加，又触发了动粒转换为聚合状态。 这种行为的重复性最终将导致姊妹染色单体在纺锤体赤道板的集聚，因为在赤道板处排斥力相等，且最小。,