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1、紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS),按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。,它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。,紫外-可见分光光度法的特点：,1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;,2 灵敏度高;,3 选择性好;,4 精密度和准确度较高;,5 用途广泛。, 1. 紫外-可见吸收光谱,物质对光的选择性吸
2、收,物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。,通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长max进行物质含量的测定。,2. 朗伯-比尔定律,一、吸光度和透光度,透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0,吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It,二、朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成
3、正比，即 A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。,朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。,式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓度表示，L用厘米表示，用代替E，称为摩尔吸光系数，单位为（Lmol-1cm-1）；当c用百分浓度（g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称为比吸光系数。它们的关系如下：,三、偏离朗伯-比耳定律的因素,（1）入射光为非单色光,（3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷
4、引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。,（2）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。,3. 紫外-可见分光光度计,主要部件的性能与作用 基本结构: 光源单色器吸收池检测器信号显示系统, 样品,在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源,1 光源,热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。,单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。,2 单色器,单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。,吸收池
5、又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。,3 吸收池,吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。,4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。,5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。,4 分析条件的选择,适宜的吸光度范围 最适宜的测量范围为0.20.8之间。,5 测定方法,单组分是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。,其定量方法包括
6、校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。,1 校准曲线法,方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。,2 标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。,As=Kcs Ax=Kcx,6 操作规程,1. 开机 开机前将样品室内的干燥剂取出，确认电源是否连接。打开仪器电源开关，等待仪器自检通过，自检过程中禁止打开样品室。,2. 使
7、用 仪器自检结束后（7个自检项目均出现 OK字样），按MAIN MENU键（主 菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校 正）；5. Data display（光度直接测量 模式）。根据需要测量的实验项目按相 应选项前的数字键，即可进入该选项的 下一级子菜单。,2.1 Phtometry（定量运算） 2.1.1 按MAIN MENU键，再按数字1键进入Phtometry子菜单下，选中对应的数字来选择所需的测定方式：%T/ABS（透过率/吸光
8、度测定模式）；Ratio（比例测定模式）；Concentration（浓度测定模式或标准曲线模式）。,2.1.2 按数字1键进入%T/ABS（透过率/吸光度测定）子菜单，选中对应的数字键来设定测定条件：NUM WL(设定测试波长的数目，最多可设定6个不同波长)；WL Setting（设定测试波长具体数值）Data Mode(选择测定吸光度或透光率)，设定完毕后点击Enter键确定，所有项目设定完毕后按数字0 键确定，等待仪器调整至准备状态。,此时屏幕上出现AUTOZERO（校零），将盛有空白溶液的比色皿放入样品室中，按Start/Stop 键进行零点的自动调整。自动调零完成后（若测定吸光度，则
9、仪器屏幕右上角显示0.000; 若测定透光率，则显示100%。若校正不理想则可按CLEAR RETURN 键返回到AUTOZERO界面，重新按Start/Stop 键再校一次零），打开样品室盖，将样品置于光路中，关上样品室盖，仪器自动测定当前样品溶液吸光度或透光率，仪器的显示屏自动给出对应波长的数值，待示值稳定后记录。,2.2 Wavelength Scan（波长扫描模式） 2.2.1按MAIN MENU键，再按数字2键进入Wavelength Scan（波长扫描模式）子菜单下，选中对应的数字键来设定测定条件：扫描的起止波长（开始波长为大波长），测量模式，图谱坐标的上下限，扫描速度等等。修改完
10、毕按数字0键确定。,2.2.2 波长扫描：分别将两个比色皿装上空白溶液和样品溶液，放入比色槽中，拉动拉杆使光路孔对准空白溶液，按Start/Stop键进行谱图扫描（如想终止扫描再次按Start/Stop键），待仪器自动进行基线校正，提示拉入样品自动测试，测试完毕后有扫描图谱出现，下方有相应的数据处理选项Process Baseline（重新进行基线校正）Print。,2.2.3 数据处理：按数字1键进入Process（数据处理），可以读峰谷值，修改坐标，显示所有数据，求一阶倒数等等功能。,3 关机 将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水冲洗比色皿至干净，用滤纸擦干；关电源将干燥剂放入样品室内，盖上
11、防尘罩，做好使用登记，得到管理老师认可方可离开。,4 要点与注意事项 4.1 开机前将样品室内的干燥剂取出，仪器自检过程中禁止打开样品室盖。 4.2 比色皿内溶液以皿高的2/34/5为宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。测定时应保持比色皿清洁，池壁上液滴应用滤纸擦干，切勿用手捏透光面。测定紫外波长时，需选用石英比色皿。,4.3 测定时，禁止将试剂或液体物质放在仪器的表面上，如有溶液溢出或其它原因将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。 4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。 4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设置是否正确（重新调整波长，并重新调零）、测量时是否调零（如被误操作，重新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波段时，要用石英比色皿）、样品准备是否有误（如有误，重新准备样品）。,