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1、双荧光素酶报告实验 实验名称：双荧光素酶报告实验实验基础知识： 荧光素酶（英文名称： Luciferase ）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis 的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ ATP）。没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况 相似）。双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培
2、养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试 不被实验条件变化所干扰。通过这种方法 , 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性 , 比如, 培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度 , 灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如 CAT, -Gal 和 GUS 是不可
3、能的, 由于它们测试化学 , 处理要求所固 有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinuspyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶的系统可满足 这些要求，在单管中完成这些测试。实验原理：将目的基因 3UTR 区域或者 lncRNA 序列构建至载体中报告基因 Luciferase 的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA 对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定 miRNA 与靶基因 3UT
4、R 的作用位点。从这两个图谱中可以发现，ppGL3-Basic 这个载体主要是用于评估 miRNA 与靶基因 3UTR 的结合，靶基因的 3UTR 放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而 pRL-TK 这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入 293 细胞中来检测荧 光时，pRL-TK 这个质粒起到一个内参的作用。3、pmir-GLO 将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，偏差更小且单质粒转染比双质粒共转染更简单。该质粒也是由promega 公司开发的，图谱如下所示：萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性
5、的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于 miRNA 靶基因验证。荧光素酶报告基因的原理在于 miRNA 主要通过作用于靶基因的 3UTR 起作用，可以将目的基因 3UTR 区域构建至 pGL3-basic载体中报告基因 Luciferase 的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定 miRNA 与靶基因 3 UTR 的作用位点。同时，为了减少内在的变化因素，
6、比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录效率的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂 LuciferaseAssay Reagent II 时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶活性。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&GloReagent 试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进 行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。实验检测步骤：一、样品准备：1 质粒转
7、染细胞（1）细胞铺板：将细胞按 50%的密度接种到细胞培养 12 孔板内。（2）转染：16h 左右细胞约 70%时转染萤光素酶报告基因质粒， 每个样品设置 3 个复孔。首先设计四组：1. 空白组（转染试剂+细胞）2. 质粒组3. 质粒+miRNA NC 组4. 质粒+miRNA mimics 组2.1 配制质粒组：按照每空 50ng 质粒，同时每孔 20ul 无血清培 养基计算需用量，标记为 A。2.2 配制 miRNA NC/mimics：miRNA NC/mimics 的终浓度为 20nM，同时每孔 20ul 无血清培养基计算需用量，分别标记为 B、C。2.3 配制对应转染试剂：按照每孔
8、0.5 L 转染试剂,同时每孔 20ul 无血清培养基计算需用量，标记为 D。2.3 稀释好的四组试剂常温孵育 5min。2.4 将稀释好的质粒 DNA 和 miRNA mimics 分别和对应转染试剂 混匀，常温孵育 20min。2.5 将 2.4 步骤中试剂对应加入孔中。2.6 转染 6h 后，换新鲜完全培养基。2 双报告基因检测（1） 质粒共转染 36-48h 后，弃去培养基，用 100 L 1XPBS 清 洗细胞。（2） 倾斜 12 孔板，吸干剩余的 PBS。（3） 去离子水将 5XPLB(裂解液)稀释成 1XPLB（现配现用）， 使用前放到常温。（4） 每孔加 50 L 稀释好的 1
9、X PLB，置摇床振摇 20-30min 以 保证裂解缓冲液完全裂解细胞。（5） 选用白色不透光的 96 孔酶标板中每孔加步骤 4 的上清液10 L， 加入 100 L 预先混好的 Luciferase Assay Reagent II ，2s 后测数据，检测荧光素酶反应强度。注意此步需在避光条件下进行。（6） 测定结束后，每孔添加 100 L 预先混好的 Stop&Glo Reagent， 静止 2s 后，测数据，检测内参海肾荧光素酶反应强度。（7） 记录读数:每个样品会有 3 个数值：RLU1萤火虫荧光素酶反应强度 , RLU2内参海肾荧光素酶反应强度 ,计算两组数据比值， 即 RLU1/RLU2。（8）分析数据：比较 1、2 组可以发现由于对照组未转染质粒，因此检测不到荧光素酶反应强度。比较 3、4 组，由于转染 microRNAmimics 进行 microRNA 的过表达，萤光素酶的活性降低，提示microRNA 可能参与抑制靶基因的表达，需要结合定点突变等方法进 一步确定 miRNA 与靶基因 3UTR 的作用位点。