戈登氏菌发酵产类胡萝卜素培养条件研究.pdf

《戈登氏菌发酵产类胡萝卜素培养条件研究.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《戈登氏菌发酵产类胡萝卜素培养条件研究.pdf（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、食品 与 发 酵 科 技 F o od a nd Fe r me nt a t i o n T e c hn o l o g y 第 4 7卷 ( 第 1期) V o 1 4 7 ， N o ， 戈登氏菌发酵产类胡萝 卜 素培养条件研究 何然 。 ， 王永泽 一 ， 王金华 1 ,2 , 3 ( 1 发酵工程省部共建教育部重点实验室 ， 湖北武汉 4 3 0 0 6 8 ； 2 湖北省工业微生物重点实验室 ， 湖北武汉 4 3 0 0 6 8 ； 3 湖北工业大学生物工程学院， 湖北武汉 4 3 0 0 6 8 ) 摘要：对一株戈登 氏菌产类胡萝 b 素的发酵培养基进行 了研究。采用单因素设计

2、 的方法筛选最适宜发酵产类胡萝 b 素的氮源、 碳源 ， 采用 P l a c k e t t B u r m a n设计筛选出对发酵产胡萝 有重要影响 的无机盐类。结果表明戈登氏菌发 酵产类胡萝 素最适碳源为蔗糖 ， 最适氮源为 K N O ， 。Mg S O ， F e S O 这两种无机盐对菌株产类胡萝 b 素具有显著性 的 影响。 最终确定发酵培养基 为： 蔗糖 2 0 g L ， 硝酸钾 4 g L ， Mg S O 0 4 g L， F e S O 1 5 m g L ， K H 2 P 0 2 g L， N a 2 H P O 3 g L ， 柠檬 酸钠 2 g L 。用此培养基

3、 ， 戈登氏菌产类胡萝 b的量可达到 6 0 0 5 m g L ， 比最初所选用的培养基提高了 2 1 2 5 。 关键词 ：戈登氏菌； 类胡萝 素； 培养基 中图分类号： Q 9 3 3 1 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 6 7 4 5 0 6 X( 2 0 1 1 ) 0 l 一 0 0 4 2 一 O 0 0 4 Re s e a r c h o f Ca r o t e n o i d s F e r me n t a t i o n M e d i u m f o r Go r d o n i a HE Ra n WAN G Yo n g - z e ， 2 , 3 WAN

4、G J i n - h u a 。 f 1 K e y L abo r a t o r y o fF e r m e n t a t i o n E n g i n e e r i n g , Mi n t ry ofE d u c at i o n ， Wu h a n 4 3 0 0 6 8 ； 2 Hu b e i P r o v i n c i a l K e y L a b o r at o r y ofI n d u s t r i al Mi c r o b i o l o g y , Wu h a n 4 3 0 0 6 8 ； 3 C o l l e g e ofB i o

5、e n g i n e e r i n g , Hu b e i U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y Wu h a n 4 3 0 0 6 8 ) Abs t r ac t ：Fe r me nt a t i o n me d i um f o r c ar o t en o i ds p r o du c t i o n by a go r do n i a s t r ai n we r e i nv e s t i g a t e dTh e s i n g l e f a c t o r de s i g n me t h o d w

6、 e r e u s e d t o s c r e e n t h e mo s t s u i t a b l e c a r b o n s o u r c e a n d n i t r o g e n s o u r c e f o r c a r o t e n o i d s p r o d u c t i o n， P l a c k e t t Bur ma n d e s i g n wa s a d o pt e d t o s c r e e n i n o r g a n i c s a l t s e f f e e t i n g o n c a r o t e

7、no i ds f e r me n t a t i o nThe Re s ul t s s h o we d t h a t mo s t s ui t a bl e c a r b o n s o u r c e a nd ni t r o g e n s o u r c e for c a r o t e no i d s f e r me nt a t i o n by g o r do n i a wa s s u c r o s e a nd KNO3 ，s e p a r a t e l y Mg S O“ F e S O4 s h o w e d s i g n i fic

8、a n c e i n fl u e n e e o n c a r o t e n o i d s f e n n e n t a t i o n T h e f e rm e n t a t i o n me d i u m w e r e s c r e e n e d a s f o l l o wi n g s ，2 0g L s uc r o s e ，4 g L KNO3 O 4g L Mg S O4 ，1 5 mg L F e SO4 ，2 g L KH2 P04 ，3g L Na 2 HPO4 ，2g L s o di um c i t r a t e Us i n g s

9、p e c i fi c f o rm a t i o n me d i u m T h e s t r a i n g o r d o n i a c o u l d p r o d u c e 6 0 0 5 mg L c a r o t e n o i d i n c r e a s i n g b y 2 1 2 5 c o mp a r e d wi t h t h e i n i t i a l f e rm e n t a t i o n me d i u m Ke y wor ds ： g or do n i a ；c a r ot e n o i d ；c ul t ur e

10、 me d i u m d o i ： 1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 4 5 0 6 X 2 0 1 1 0 1 0 1 0 类胡萝 b素( C a r o t e n o i d ) 是一类呈黄色 、 橙红色 或红色的多烯类化合物。 自然界 中存在着 6 0 0多种 类 胡 萝 b 素 ，其 中的 5 0多种 具有 维生 素 A原 的 活 性 。 其中以 B 一 胡萝 卜 素( B e t a c aro t e n e ， B c ) 作为维生 素 A原的活性最强，被认为是人体获得必需的维生 素 A的重 要来 源 。 目前 ， B c已被作 为食 品添 加剂 和

11、营养增补剂 ， 在全世界广泛使用】 j 。 天然类胡萝 卜素有很好 的抗癌作用四 。 天然产物 提取的类胡萝 卜 素具有极高的生物活性 ，但是受地 域、 原料和得率等种种因素限制而无法大规模生产 ； 微生物发酵法因不受环境等条件 的影响 ，而具有成 本低 ， 工艺简单 ， 质量稳定等优势。 目前已发现的产类胡萝 b素的菌株主要为光合 细菌 ， 霉菌 ， 酵母 和藻类【 。 其 中光和细 菌需要光 照 ， 不适合 发酵 罐大量 培养 ；霉 菌 中如运 用较 普遍 的三 孢布拉霉菌 ，由于其丝状真菌的特点导致其发酵调 控工艺较为复杂 ；酵母如红酵母生产类胡萝 b 素的 产量相对较低 ； 而藻类 由

12、于受产地和季节的限制 ， 而 收稿 日期 ：2 0 1 0 1 2 1 5 基金项 目： 发酵工程省部共建教育部 重点实验室开放基金( 项 目编号 ： 2 0 0 9 K F J J 0 6 ) 作者简介 ： 何然( 1 9 8 5 - 1 ， 男， 汉 ， 湖北钟祥人 ， 研 究方 向： 生物化工。 第 4 7卷 ( 蕙第 1 6 1积 ) 何然等 ： 戈登 氏菌发酵产类胡萝 卜素培养条件研究 4 3 无 法大规模 推广 。因此有 必要 进 一步发 掘 新 的种属 的类胡萝 卜 素生产菌株。 在前期 的工作中， 我们获得 一 株能产类胡萝 b 素 的放线菌株 ，通过分子和生理 生 化鉴定鉴

13、定为戈 登 氏菌( g o r d o n i a s p ) ， 戈登 氏菌 可 以产类胡萝 卜 素阁， 该菌菌体不为丝状且发酵产类胡 萝 b 素产量较酵母高。 为了进一步提高该戈登氏菌产 类胡萝 b 素的产量 ， 本文对其产类胡萝 卜 素培养基进 行 了研究 。 比较其 在 7种不 同培养基 中产类胡 萝 卜 素 情况 ， 选取其 中产类胡萝 卜 素较高培养基 ， 在此培养 基基础上 ，筛选最适宜发酵产类胡萝 卜 素的氮源 、 碳 源，同时采用 P l a c k e t t B u r ma n设计筛选出对发酵产 胡萝 卜 有 重要影响 的无 机盐类 ， 以期获得适 合该 戈登 氏菌发酵

14、产类胡萝 卜素的培养基配方。 1 材 料与方 法 1 1 实验 材料 1 1 1 菌种 来 源 一 株产类胡萝 卜 素的戈登氏菌 ( g o r d o n i a s p ) ， 编号 HB U T Y，由湖北工业大学省部共建教育部重 点实验室菌藏中心提供。 1 1 2 培养 基 ( 1 ) 麦 芽 汁 斜 面 培 养 基 ( 活化 培 养 基 ) ： 麦 芽 汁 5 0 g ， 葡萄糖 2 0 g ， 酵母膏 2 O g ， 琼脂 2 0 g ， 定容至 1 L， p H7 0。 ( 2 ) 种子培养基( g L ) ： 蔗糖 S g L ， 柠檬酸钠 2 g L， ( N H 4 ) 2

15、 H P O 4 4 g L， K H 2 P O 4 2 g L， N a 2 H P O 4 3 g L， Mg SO4 7 H2 0 0 2 g L， Ca C1 2 2 H2 0 1 0 mg L，F e S O4 5 mg L， 蒸馏水 1 L ， p H 自然 。 ( 3 ) 发酵培养基( g L ) ： 蔗糖 1 5 g L ， 柠檬酸钠 2 g L ， KNO3 4 g L ， KH2 P O4 2 g L， Na 2 HP O4 3 g L， Mg S O 4 7 H2 O 0 2 g L， F e S O 4 5 mg L ， 蒸 馏水 1 L ， p H 自然 。 1 2

16、 实验 方 法 1 2 1 菌株 培养 ( 1 ) 斜面活化 ： 将戈登氏菌接种在麦芽汁斜面培 养基 上活 化 ， 2 8 ， 培养 4 8 h 。 ( 2 ) 种子培养 ： 从新鲜斜 面接两环到装有 5 0 m L 种子培 养基 的 2 5 0 m L三角 烧瓶 中 ， 2 8 o C， 2 2 0 r rai n培 养 4 8 h 。 ( 3 ) 液体发酵培养 ： 取种子液 3 m L， 即 6 的接种 量 接种 到装有 5 0 mL发酵 培养 基 的 2 5 0 m L的 三角烧 瓶 中， 2 8 ， 2 2 0 r m i n培养 1 4 4 h 。 1 2 2 菌体生物量， 干重及类

17、胡萝 b 素的测定 菌体 生物量 和干重 的测定 按照 如下方 法 ， 取 5 mL菌液于离心管中， 4 2 0 0 r mi n离心 1 5 mi n ， 得湿菌 体 ，倒掉上清液 ，称重得菌体湿重即生物量 ，然后 8 0 烘干 2 4 h称其干重 。 一 类胡萝 卜素的测定按照酸热法1 6 1 进行测定 ， 用丙 酮提取后 ， 合并提取液 ， 于 4 7 7 n m处测量其 O D值。 1 2 3 菌株的培养基研究 ( 1 ) 选用 7种培养基对该菌株进行培养 ， 然后测 定类胡萝 卜 素产量， 菌体生物量及其干重。 ( 2 ) 然后选取蔗糖 ， 葡萄糖 ， 麦芽糖 ， 可溶性淀粉 四种碳

18、 源 的 添加 量为 1 0 g L ， 其 他成 分 与无 机盐 培 养 基成分相 同。观察并测定菌株在不同碳源中的生长 及产类胡萝 t- 素情况。 ( 3 ) 选择 8种不同氮源 ， ( N H 4 ) z HP O 4 ， ( N H 4 ) 2 S O 4 ， K N O 3 ， ( N H 4 ) HP O 和( N H 4 ) S O 各一半 ， 酵母粉 ， 蛋 白 胨 ， 豆粕粉 ， 尿素 ， 八种氮源 的添加量为 l 0 g L， 观察 并测定菌株在不同氮源 中的生长及产类胡萝 b 素的 情况 。 ( 4 )对影响菌株产类胡萝 - 素的 8个无机盐因 素进行考察 ，对影响菌株类

19、胡萝 卜 素产量的无机盐 运用选用 8因素的 P l a c k e t t B u r m a n( N= 1 2 ) 设计 ， 筛选出对类 胡萝 b素产量具有显著性影响 的无机 盐。实验中所运用 的 P B设计 ， 把每个因素设计成高 ( + 1 ) 和低( 一 1 ) 2 个水平 。实验设计见表 1 ， 各因素所代 表的参数、 水平见表。 表 1 N= I 2的 P l a c k o t t R u r ma n试验设计 T a b 1 T h o d e s i g n o f P l a c k o t t B u r ma n( N = 1 2 ) 批 次 Xl X2 X3 X4

20、 X 6 X7 l 1 1 1 1 1 一l 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 1 6 l l 7 1 l 每组试验重复 3次； Y代表类胡萝 卜 素产量； 单 位为 mg L ； “ 1 ”“ 一 1 ” 代表高和低 2个不同的水平。 2 结果 与分析 2 1 戈登氏茵对七种培养基的不同利用情况 选用 7种培养基 8 1对该菌株进行培养 ， 然后测定 其色素产量，菌体生物量及其干重。从表 1可以看 出 ， 在无机盐培养基中培养的菌株的生物量 、 菌体干 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 8 9 m 食 品 与 发 酵

21、 科 技 2 0 1 1 年第 1 期 重、 色素浓度均为最高 ， 故无机盐培养基为戈登氏菌 的最适 合 的培 养基 。 表 2 在七种不同培养基中培养戈登氏菌产类胡萝 卜 素情况 Ta b 。 2 Ca r o t e n o id p r o d u c t io n b y a g o r d o n ia s t r a in u s i n g s e v e n f e r me n t a t io n me d i u m 2 2 碳 源 优 化 2 2 1不 同碳源的利用情况 选 择 4种 不 同碳源 ， 其他 培养基成 分相 同 的情 况下培养 ， 菌株的生物量及干重测定数

22、据如表 2 表 3 戈登 氏菌在不同碳源 中类胡萝 1- 素产量 Ta b 3 Ca r o t e n oid p r odu c t io n b y a g o r d o n ia s t r a in i n d iffe r e n t c a r b o n s o u r c e 发酵 6 d后 ， 测定色素和干重发现， 以蔗糖为碳 源的培养基 ， 色素产量和干重均为所选用碳源中的 最 大值 。 2 2 2 不 同蔗糖 浓度对 菌株 生长 的影 响 在不 同 的蔗糖添 加浓 度下对 戈登 氏菌进行 了培 养 ， 菌株的生物量及色素产量测量数据如表 3 ： 表 4 戈登氏菌在不

23、同蔗糖添加浓度的类胡萝 I- 素 Ta b 4 Ca r o t e n o id p r o d u c t i o n b y a g o r d o n i a s t r a i n in d iff e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f s u c r o s e 从 表 4可 以看 出 ，当蔗 糖 的 添加 浓 度 为 2 0 L 的时候 ， 菌种产色素量和生物量最大。 2 3 氮 源优 化 2 - 3 1 不 同氮 源的利 用情 况 选择 8种不同氮源，其他培养基成分相同的情 况下培养 ， 菌株的干重及色素产量测量数据如表 4 。 从表

24、4可以看出， 在色素产量和干重方面 ， 添加 了以 KN O 为氮源的培养基均最高 ，故可以得出结 论 ， K N O ， 为最佳氮源。 2 3 2 不 同硝酸 钾浓度 对菌 株 的影 响 表 5 戈登氏菌在不 同氮源中类胡萝 卜素产量 T a b 5 Ca r o t e n o i d p r odu c t io n b y a g o r d o n ia s t r a i n in d iff e r e n t n it r o g e n s o u r c e 在不同的硝酸钾添加浓度下进行培养 ，菌株的 生 物量及 色素产 量测 量数据 如表 5 。 表 5戈登氏菌在不同 K

25、 N O 。 添加量的类胡萝 卜 素产量 Ta b 5 Ca r o t e n o id p r odu c t i o n b y a g o r d o n i a s t r a in i n d iff e r e n t c o n c e n t r a t io n o f KN O3 从干重以及色素产量可以看出， 当硝酸钾添加 量为 4 g L时， 菌株色素产量最高。 2 4 无机 盐优 化 2 4 1 P l a c k e t t B u r m a n试验 根据菌株生长所需营养要素和结合相关的文献 报 道及 预实验 ， 选取 8种 无机盐 ， 进行 P l a c k

26、e t t - B u r ma n设计 ， 按照设计的培养基进行发酵实验 ， 每 组重 复 3次 ， 结果见 表 6 。 表 6 无机盐对戈登 氏菌产类胡萝 1- 素的影响 T a b 6 E ff e c t o f d iff e r e n t i n o r g a n ic s a lt o n c a r o t e n o id s p r od u c t io n b y a g o r d o n ia s t r a in 通过 S A S软件分析， 发现代码为 x 和 x 3 的t 值 相对较大 ， 表明， Mg S O ， F e S O 这两个无机盐对菌株 产类胡

27、萝 卜 素具有显著性 的影 响( P O 0 5 ) ， 而其 它 的因素没 有显 著影 响。 2 4 2 无机盐的不同添加浓度对菌株的影响 Mg S O ， F e S O 这两个无机盐对菌株产类胡萝 I- 素具有显著性的影响，故选取这两种无机盐做不同 第 4 7卷( 慝第 1 6 1研) 何然等 ： 戈登氏菌发酵产类胡萝 卜 素培养条件研究 4 5 浓度 添加 实验 ， 结 果见 表 7和表 8 。 表 7 不同 Mg S O 添加量对戈登氏菌产类胡萝 卜素的影 响 Ta b 7 E ff e c t o f d iff e r e n t Mg S O c o n c e r n t r

28、 a t io n o n c ar o t e n o id s p r o du c t io n b y a g o r d o n ia s t r a i n 从上述数据可以看出， 当 Mg S O 添加量为 0 4 fi 的时 候 ， 色 素 产 量 达 到 最 大 ， 故 0 4 g L为 Mg S O 4 的 最佳添加量。 表 8 不 同 F e S O 添加量对戈登氏菌产 类胡萝 I - 素的影响 Ta b 8 E ff ect o f d i ff e r e n t F e S O4 o o n c e r n t r a t io n O ff c a r o t e

29、n o id s p r o d u c t i o n b y a g o r d o n ia s t r a i n 从 上 述 数 据 可 以 看 出 ， 当 F e S O 添 加 量 为 1 5 m g L时 ， 色 素产 量达 到最 大 ， 故 1 5 mg L为 F e S O 的 最佳 添加 量 。 3 结论 对一 株初 步 鉴定 为 戈登 氏 菌 ( g o r d o n i a s p ) 的放 线菌发酵产类胡萝 卜素的培养基进行了研究 ，结果 表 明该 戈 登 氏菌 发酵 产 类 胡 萝 卜 最适 碳 源 为 蔗糖 ， 最适氮源为 K N O 3 。 Mg S O ，

30、 F e S O 这两种无机盐对菌 株产类胡萝 卜 素具有显著性的影响。最终确定发酵 培养 基为 ：蔗 糖 2 0 L，硝 酸钾 4 L ， Mg S O 0 4 g L， F e S O 4 1 5 m g L ， K H 2 P O 4 2 g L， N a 2 H P O 4 3 g L ， 柠檬酸钠 2 g L 。在此条件下， 戈登氏菌产类胡萝 卜的量可达到 6 0 0 5 mg L ， 比出发所选用的培养基提高了 2 1 2 5 。 利用微生物生产类胡萝 卜 素是获得生物资源型 类胡萝 卜素的最重要的途径。类胡萝 卜 素普遍存在 于藻类 、 细 菌和真 菌 中。 其 中藻类 由于受产

31、 地和 季节 的限制， 而无法大规模推广。 沼泽红假单胞菌是 目前 光合细菌 中应用 和研究得较 为广泛 的光合 细菌之 一 ，其类胡萝 卜 素产量可达 5 0 2 mg g 9 1 。其 中不同类 型真菌合成的类胡萝 卜 素种类差别较大 ，酵母和霉 菌中的一些种类合成类胡萝 卜 素的能力备受关 注， 成为工业发酵生产的选择对象 。其 中如红酵母的类 胡萝 卜 素 的产量为 1 5 mg L左右， 三孢布拉霉的产 量可达到 2 8 6 0 mg L t “ 1 ， 但三孢布拉霉属于丝状真菌， 发酵液粘稠 ， 其发酵工艺复杂 ， 而戈登氏菌无菌丝 ， 易于液体发酵用于生产，且 目前类胡萝 卜素产

32、量可 达到 6 0 0 5 mg L ， 具 有较 好 的生产应 用前 景 。 参考 文献 ： 【 l 】 王庆伟 类胡 萝素 的研 究进展 与临床应 用【 J J _ 中 国药 事 ， 2 0 0 0 ， 1 4 ( 1 ) ： 5 8 - 6 0 【 2 】 S i n g h P ， G o y a l G K C o m p r e h e n s i v e R e v i e w s i n F o o d S c i e n c e a n d F o o d S a f e t y J J o u r n a l o f A p p l i e d M i c r o b i

33、o l o g Y， 20 08， 7： 25 52 56 3 】 Q i u B a o S h e n g ， I j u Q i f a n g A c t a H y d r o b i o l o g i c a S i n i c a ， 2 0 0 0 ， 2 4 ( 5 ) ： 5 4 6 5 5 4 4 1 S c h m i d i D C E n g i n e e r i n g n o v e l c a r o t e n o i d s i n m i c r o o r g a n i s m s J 1 C u r r e n t O p i n i o n

34、i n B i o t e c h n o l o g y ， 2 0 0 0 ， 1 1 ( 3 ) ： 2 5 5 2 6 1 【 5 】 S h i n i c h i T a k a i c h i ， T a k a s h i Ma o k a ， N a o s h i g e A k i m o t o ， e t a1 Ca r o t e no i ds i n a Co r y n e ba c t e r i ne a e， g o r d on i a t e rra e A I S T 一 1 ： C a r o t e n o i d s G l u c o s

35、y l M y c o l o y l E s t e r s 【 J B i o t e c h n o l o g y ， 2 0 0 8 ， 7 2 ( 1 0 ) ， 2 6 1 5 2 6 2 2 【 6 】 温朗聪 ， 等 红酵母生物合成类胡萝 素研究进展【 J J 中国 微生态学杂志 ， 2 0 0 4 ， 1 6( 1 ) ： 5 9 6 O 【 7 C h u a n b i n L i u ， Y a n L i u ， We i L i a o ， e t a 1 A p p l i c a t i o n o f s t a t i s t i c all y - b

36、a s e d e x p e r i me n t a l d e s i g n s f o r t h e o p t i mi z a t i o n o f n i s i n p r o d u c t i o n f r o m w h e y 四B i o t e c h n o l o g y l e t t e r s ， 2 0 0 3 ， 2 5 ( 1 1 ) ： 8 7 7 8 8 2 【 8 】 沈 萍 微 生物 学 实验 MI 北 京 ： 高等 教育 出 版社 ， 1 9 9 9 ： 21 4-21 8 9 】 周佳 ， 郭秒 ， 黄遵锡 一株 高产类胡 萝 素

37、光合细 菌 z I 的 研究【 J J 中国食 品添加剂 ， 2 0 0 3 ， 0 3 ： 1 1 - 1 7 1 0 1 赵颖 ， 罗璇 ， 钟 晓凌 ， 等 响应 面法优化产类 胡萝 卜 素红 酵母液体发酵培养基的研究【J J 化学与生物工程， 2 0 0 7 ， 2 4 ( 1 2 ) ： 3 9 4 2 1 1 顾秋亚 ， 缪静 ， 余 晓斌 植 物油和大 豆卵磷脂对 三孢布 拉霉合成 p 一 胡 萝 卜 素的影响【J 食 品科学 ， 2 0 0 8 ， 2 9 ( 1 2 ) ： 477 -4 80 全法规配套完善 ， 推动 保健食品监督管理条例 出台。 陈竺指 出， 2 0 1 1年在加强食品安全方 面主要 有五 工作 ：一是进一步完善食品安全综合协调机制 ， 品安全信息统一公布制度。 二是落实食 品安全整 开展食品安全标准宣传 、 培训和跟踪工作。四是推进国 家食品安全风险评估机构组建 ， 加强预警体系及风险评 估 能 力 建 设 。 五 是 完 善 食 品 安 全 重 大 事 故 查 处 制 度 ， 提l 高 突 发 食 品 安 全 事 件 应 急 调 查 和 处 置 能 力 。 l ! 一 一 ： 一一一 ； ! ； ! A ； 一 ；