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1、体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,1,体内药物分析,Biopharmaceutical analysis,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,2,第一章 体内药物分析概述,一、体内药物分析的定义 狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析 广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,3,二、体内药物分析的意义,（一）在新药评价 和开发中的意义 1全面质量控制 2新药报批 3为设计新药提供信息 从代谢产物中开发新药 保泰松羟基保泰松（作用
2、强、副作用小） 非那西丁扑热息痛 前药设计 新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等 以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,4,（二）临床合理用药中的意义 1血药浓度与药理作用,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,5,2. 影响血药浓度的因素,（1）机体因素 a生理因素 年龄、性别、生理状况 b病理因素 c遗传因素 （2）药物因素 a剂型因素（生物利用度问题） b药物合并使用（酶抑、酶促） c时间因素,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,6,（三）药物中毒解救的意义 （四）兴奋剂检测的意义,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,7,三、体内药物分析
3、的对象,3从样品的来源分,1从分析物分,母体药物 代谢物 内源性物质,2从生物样品种类分,均匀样品 非均匀样品,人体 实验动物,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,8,四、体内药物分析的任务,（一）方法学的研究 （二）治疗药物监测 TDM，therapeutical Drug Monitoring 1定义 2哪些药物需进行体内血药浓度监测,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,9,有效血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效 剂量小，毒性大的药物 个体差异大，剂量难以控制 药物毒性反应与疾病症状相似 多种药物合并应用，有中毒危险 胃肠道、肝脏、肾脏疾病 呈非线性动力学的药物 判断患者用药的
4、依从性,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,10,（三）药代动力学的研究 （四）代谢分型的应用 （五）内源性物质测定,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,11,五、体内药物分析的特点,1干扰杂质多 2样品浓度低 3取样量少 4工作量大 5时间短 6有一定设备,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,12,六、体内药物分析的发展,1国外发展概况 60年代初发现药效与血药浓度关系 70年代体内药物分析方法建立 80年代至今发展迅猛，新仪器不断涌现 书籍出版 Drug Level Monitoring1980 Therapeutical Drug Monitoring1981 Textboo
5、k of Biopharmaceutic Analysis1981,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,13,2国内情况,80年代初，药物分析工作者倡导，1980年版药物分析教材中纳入部分内容，第二、三版增加体内药物分析一章。第四版、第五版取消，各学校开设体内药物分析课程。 80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,14,有关书籍,吴如金体内药物分析人卫版1984 陆明廉血药浓度测定与临床应用上海科技1986 陈刚治疗药物监测理论与实践人民军医1988 吴莱文治疗药物监测人卫版 1989 曾经泽生物药物分析 北京大学出版社 1998 姚
6、彤炜体内药物分析浙大2001 张君仁体内药物分析 化学工业出版社2002,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,15,3学科前沿,游离药物浓度测定 直接进样方法研究 代谢物测定 对映体分析,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,16,第二章 体内药物存在的状态与 体内药物分析的关系,一、药物的体内变化 吸收分布代谢排泄 ADME过程 发生两种变化 物理变化 可逆变化 化学变化 结构和数量发生变化,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,17,二、药物与血浆蛋白的结合,1游离型药物与结合型药物（非特异性的结合） 在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物 尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中
7、P为血浆1/10 与药物 结合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性药物主要与白蛋白结合 弱碱性药物与白蛋白、a1-酸性糖蛋白结合 药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,18,2血浆蛋白结合率 Df+P Db K= 解离常数 血浆蛋白结合率： = =,PDf,Db,Db,Db+Df,1,1+K/np+Df/np,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,19,结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。 由此可见，K、np是影响的重要因素 np K 药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，
8、多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,20,3血浆蛋白结合的测定 平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。 （1）平衡透析法 原理 计算 = 100% =Ct-Cf/Ct100%,袋内-袋外,袋内药物,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,21,注意事项,a. 蛋白质溶液 新鲜血浆 pH7.4，至少三个浓度测定 b. 缓冲液 0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4 抑制酸性药物与蛋白质结合 c. 温度与平衡时间 37 1648h 注意防腐剂加入，药物的分解 d. 透析袋 渗漏检测 3%三氯
9、醋酸 e. 搅拌 保持动态平衡,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,22,影响因素,a. 药物膜上吸附 b. Donnan效应 由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。 c. 空白值增加 d. 缓冲液体积变化，水分进入血浆 游离药浓 此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,23,（2）超滤法,原理 计算 注意事项 a装置 50l5ml，选择不同型号超滤膜，保湿。 b速度与时间 300010000r/min 515min c温度 37，25，4 影响因素 a膜吸附 b超滤液的体积 超滤液/总体积0.
10、30.6 c超滤膜温度,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,24,三、药物与血浆蛋白结合对体内药物分析的影响,1血浆不同对体内药物分析的影响 2平衡状态不同对体内药物分析的影响 3平衡状态受破坏对体内药物分析的影响 4游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,25,四、药物代谢,1研究药物代谢的意义 了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全 有效 研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新 药 研究药物相互作用机制 有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,26,2药物代谢的途径,第一相反应：
11、在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强 第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,27,氧化反应 还原反应 水解反应 结合反应 a葡萄糖醛酸结合 b硫酸酯化 c谷胱甘肽缀合 d乙酰化结合 e氨基酸结合,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,28,五、药物代谢与体内药物分析的关系,1样品的保存 样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。 2分析方法选择 光谱法 色谱法 免疫法 3样品的提取、分离法 代
12、谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开 尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,29,第三章 生物样品的预处理,一、生物样品的采集与贮藏 体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,30,（一）样品的采集,1血样 血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。,血细胞,血浆（plasma）,血小板,血清（serum）,血细胞,测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓,抗凝,自然,全血,血液,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,31,2尿样 目
13、的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离 3唾液 唾液中药浓与血浓相关性 收集方法 离心 收集,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,32,（二）样品的贮藏,1血样（血浆、血清）及时分离冷藏， -70加入稳定 剂NaF 2尿样 尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4保存 加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变 3唾液：同血样,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,33,二、生物样品的预处理,（一）预处理的目的 存在形式的多样性 游离 结合 代谢物 浓度低，杂质多（分离浓缩） 出现浑浊和沉淀 与试剂起反应 影响色谱柱寿命,体
14、内药物分析培训讲义(63)-医药保健,34,（二）处理方法选择的一般原则,1药物理化性质 pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性 2浓度范围 灵敏的方法 3测定的目的 定性 定量 母体 代谢 4生物样品的种类 5样品处理与分析方法的选择 专一性 灵敏性,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,35,（三）生物样品去蛋白处理,1加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl 2加入酸性沉淀剂 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,36,3组织酶消化法
15、 加入酶使蛋白质水解 优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化 4其他 加热 超滤,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,37,（四）生物样品缀合物水解,1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 37 3溶剂解 某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,38,（五）生物样品的萃取,1液-液萃取 （1）优点：与杂质分离 简便 浓集 提取率高 （2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取， 70%重现性,
16、体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,39,（3）影响提取率的因素 pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH 提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应 离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,40,（4）离子对提取,对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取 原理 应用 阴离子：COOH+ SO3H- 反离子 四丁基铵 阳离子：NH2+ 反离子烷基或芳基磺酸盐 （5）提取技术 一般在试管中进行 有机相与水相比1:1或2:1,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,41,（6）乳化问题 措施 轻
17、缓振摇 含有分散度大或不溶物应过滤掉 避免在高pH条件下，从水中提取药物 避免使用易发生乳化的溶剂 萃取剂水中加入少量NaCl,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,42,破孔方法 机械法 加入少量高级脂肪醇 改变表面张力 改善混合溶剂比例，增加分散相分数,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,43,（7）药物的吸附 玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷 血浆,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,44,2液固萃取,固相萃取solid phase extraction SPE 针管式 抽空减压 加压 过滤,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,45,（1）固相萃取步骤,固
18、相选择 样品1ml 1ml规格固相 125ml 3ml规格固相 固相处理 反相C18 固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态 上样 分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相 洗脱待测物 改变pH或极性,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,46,（2）影响固相萃取的因素,（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 510mlmin-1 洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg） （2）装样 过载 突破性试验 已知浓度样品液 小体积上柱洗脱回收百分率 加大体积洗脱回收百分率 绘图 当回收率下降时为过载,
19、体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,47,（六）生物样品的组分浓集 （七） 衍生化处理 GC衍生化 HPLC衍生化,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,48,第四章 体内药物分析方法的建立与评价,一、分析方法,根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,49,二、分析方法的设计依据,方法的建立,原始方法改进创新 创立方法,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,50,1做好文献总结 2充分了解药物特征及体内状况 pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况 3明确测定目的、要求 目的 4结合实验室条件 设备条件
20、 预处理方法,药浓监测 药代动力学研究 母体药物和代谢物,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,51,三、分析方法的建立,1纯品进行测定 确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T） 2空白样品测定 确定空白样品是否有干扰 3以水代替空白样品，加标准液后测定 了解提取率、检测浓度 确定萃取条件、pH、挥发浓缩等 4空白样品加入标准液测定 标准曲线建立 回归方程 回收率 5实验样品测定,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,52,四、分析方法的评价,可行性和可靠性 1准确度 accuracy 测定结果与真实性的差异 用回收率表示 接近100% 相对恒定,体内药物分析培训讲义(63)-医药保
21、健,53,绝对回收率 也称萃取回收率、提取回收率 测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率 考虑3个浓度（高、中、低） 分布在标准曲线成上、中、下 一般要求绝对回收率在70% 一般方法HPLC内标 内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值10%,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,54,相对回收率 方法回收率 药物系列浓度+血样标准曲线 取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值15%，定量限20%,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,55,注意问题： a加入药量与实际测定值相近 b加入物与实际存在状态相近 c空
22、白试验 与已确定方法进行比较,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,56,2精密度precision,标准差SD 相对标准性偏差 RSD不大于15%，定量限不大于20% 日间精密度日内精密度,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,57,3灵敏度（sensitivity） 检测的最小量,（1）检测限（LOD） 从背景中检测到的最小药物浓度：S/N3的绝对量 LOD=3N/S （N噪间 S被测物信号/单位重量） N=1mm 取2gml样品，20l进样 峰度30mm LOD=4ng,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,58,（2）定量限(LOQ) 在一定精密度和准确度前提下求得最低检测量，通
23、常以标准曲线最低点作为一定量限，也可S/N=10作为定量限，实际测定时，满足35个半衰期浓度，或Cmax1/101/20,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,59,（3）最低检测浓度 可以进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大小等因素有关 最低检测浓度=LOQ/进样体积 体内浓度检测限=仪器浓度检测限稀释度 1ml0.1ml 体内检测限=仪0.1 1ml10ml 体内检测限=仪10,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,60,（4）提取灵敏度的方法 提取仪器灵敏度 提取进样量 降低仪器噪音 提取浓度程度,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,61,4专属法（specificity）选择性 同时受试药物合并应用的药物，体内代谢物等 5线性范围（Linear range）,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,62,6稳定性（stability） （1）长期贮存稳定性-20-70 （2）短期室温稳定性室温放置424h （3）冷冻解冻稳定性冷冻解冻冷冻解冻 （4）贮备液稳定性贮备液在室温或冷冻条件下,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,63,五、应用实例,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,64,体内药物分析培训讲义(63)-医药保健,65,