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1、多位点序列分型 Multilocus Sequencing Typing MLST Contents 两种分型方法的比较较 MLST的步骤骤 MLST的方案设计设计 MLST的由来 实实例分析 多位点酶电泳（Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE） 根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异 选定 管家酶 淀粉 胶检 测 不同电泳迁移速率 电泳谱 等位基因 的变异性 揭示微生物 基因多样性 MLEE的缺点 不能推断特殊位点的碱基序列 不同实验实验 室间间的分型结结果不能进进行比 较较 MLST的首次使用 MLST是由多位点酶电电泳(MLEE)衍生出来 的 一种分型
2、方法 在1998年,Maiden等首次将MLST应应用于 脑脑膜炎奈瑟菌分型 多位点序列分型 （MLST） 一种基于核酸序列测定的细菌分型方 法 通过PCR扩增多个管家基因内部片段 测定其序列，分析菌株的变异 MLST的原理 MLST方法一般测测定610个管家基因内部 400600bp的核苷酸序列，每个位点的序 列根据其发现发现 的时间顺时间顺 序赋赋予一个等位基 因编编号，每一株菌的等位基因编编号按照指 定的顺顺序排列就是它的等位基因谱谱 ，也即 是这这株菌的序列型（sequence type,ST ）。这样这样 得到的每个ST均代表一组单组单 独的 核苷酸序列信息 。 序列型（ST） 序列
3、型（ Sequence-typying, STs ）等同 于MLEE得出的电电泳型(Electrophoretic type, ET） 通过过比较较ST可以发现发现 菌株的相关性,即密 切相关菌株具有相同的ST或仅仅有极个别别基 因位点不同的ST,而不相关菌株的ST至少有 3个或3个以上基因位点不同 MLST分析方法 MLST技术针对术针对 看家基因设计设计 引物对对其进进 行PCR扩扩增和测测序,得出每个菌株各个位点 的等位基因数值值, 然后进进行等位基因图谱图谱 (allelic profile)或 序列类类型(sequence types, STs)鉴鉴定， 再根据等位基因图谱图谱 使用
4、配对对差异矩阵阵 (matrix pair-wise differences)等方法构建 系统树图进统树图进 行聚类类分析。 MLST方案的设计设计 三要素： 选择经过选择经过 初步筛选筛选 的菌株 选择选择 具有独特特征的基因位点 设计设计 用于基因扩扩增和序列测测定的引物 1. 菌株的选择选择 根据已有的分型方法和流行病学资资料，选选 择择100株左右具有代表性的菌株作为为分析 对对象。 理论论上，这这些选选定的菌株要代表所研究细细 菌的群体，而不是仅仅仅仅 包含那些对对人致病 的克隆。 收集的菌株最好具有代表性，不仅仅仅仅 由一 个亚亚型组组成。 2.管家基因的确定 全基因组组序列的测测
5、定大大方便MLST位点 的选择选择 一般选择选择 10到20株菌评评价10至15个 备选备选 位点。 最终终采用 7个位点进进行后续实验续实验 和分析。 如果需要提高分辨力，可以加入个别别非保 守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基 因，这样这样 比增加管家基因的个数将更有效 3.引物的设计设计 目的片段长长度：400600bp 所有引物调调整为为同一退火温度， 以适用于 大范围围流行病学监测监测 和群体研究 为为了发现发现 引物结结合位点可能存在的变变异， 每个位点都应该设计应该设计 一对对以上引物 http:/pubmlst.org/ 实际 运用中，对于已有的成熟MLST方案 的细菌，可直接
6、从MLST数据库中获取方 案。 http:/pubmlst.org/ MLST的步骤骤（二） 核酸序列信息的获获取 收集病 原微生 物标标 本 基因 组组 DNA 的获获 取 PCR 扩扩增 目的基 因片段 目的片 段的核 酸序列 测测定 整合核 酸序列 信息 MLST的步骤骤（三）结结果分析 结结果分析 根据分析的细细菌群体组组成 1.以等位基因编编号和ST编编号为为基本分析单单 位 提交到MLST分析网络络服务务器（www.mlst. net） START和eBURST 2.直接分析核苷酸序列 上传传到GenBank比对对服务务器进进行BLAST比对验对验 证证 数据分析得到 等位基因图谱
7、图谱新的STs则则找 出对应对应 的 clonal complex 在数据库库中 找出相应应的 STs 群体进进化研究 分子流行病学 研究 菌群结结构 调查调查 菌群遗传遗传 学分析 疾病的全 球性监监控 鉴鉴定暴发发 性疾病的 病原体 MLST结果分析流程图 ST和克隆型 遗传遗传 学上具有相关性但并不相同的细细菌的 集合,被称为为是同源复合体(The clonal complex),也叫克隆型。 以其核心的基因型来命名。 MLST和PFGE的比较较 两种不同的分子分型技术术 不同分子分型方法比较较 分型方法分型力可分辨率可重复性结结果易解 释释性 易操作性费费用 RAPD较较好较较高一般一
8、般简简便低 PCR- RFLP 好一般一般一般简简便低 AFLP较较好高一般好简简便中 MLST较较好较较高好好简简便较较高 PFGE好高好好复杂杂较较高 MLVA很好高好好简简便高 MLST和PFGE的比较较 两种不同的分子分型技术术 脉冲场场凝胶电电泳（PFGE） 比较所确定的高度变异片段 高分辨力 不适于进行全面的流行病学 调查及生物进化分析 不同实验间 重复性较差 标准化技术 数据库 多位点序列分型（MLST） 比较进化较慢的位点 标准化技术 数据库 不同实验室间重复性好 不适用于同血清型菌株间比 较 MLST实实例分析 1.MLST方案（同MLST Database） 2.核酸序列信息的获取 2.1样本来源 54株结肠 弯曲菌(C.coli)分离于2002年零 售禽肉中，均为不重复菌株 2.2PCR扩增 2.3测序 3.结果分析 3.1.MLST数据提交 将测序序列在线递 交至弯曲菌MLST数据库 ()进行分析,得出等位基因 型、序列型以及序列型克隆系。 3.2UPGMA分析ST序列型的发育 树 谢谢 ！