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1、老鹰茶总黄酮降血糖作用的实验研究中国中医药科技2OO8年3月第15卷第2期Mar.2O08Vo1.15No.2?ll9?老鹰茶总黄酮降血糖作用的实验研究*吕雄文李俊邹宇宏金涌程文明章秋黄艳张骏艳(安徽医科大学药学院?合肥230032)摘要目的:观察老鹰茶总黄酮(比)的降血糖作用,并探讨其作用机制.方法:TFLC连续5天灌胃正常小鼠,观察其降血糖作用.采用肾上腺素腹腔注射,四氧嘧啶尾静脉注射和链脲佐茵素腹腔注射制备糖尿病小鼠和大鼠模型,观察TFLC的降糖作用以及对血清胰岛素(INS)和血脂的影响.结果:TFLC可降低正常小鼠的血糖值;显着对抗由肾上腺素引起的小鼠血糖升高,明显降低四氧嘧啶糖尿病小
2、鼠血糖,并升高血清INS水平,显着降低链脲佐茵素糖尿病大鼠模型的血糖和血清TC,TG,LDLC含量,同时升高血清HDLC含量.结论:TFLC具有明显的降血糖作用,其机制与其促进INS分泌和调节脂质代谢紊乱有关.主题词糖尿病/中医药疗法老鹰茶总黄酮/治疗应用老鹰茶总黄酮/药理学血糖/药物作用大鼠小鼠老鹰茶(L/tsea(forearm),又称豹皮樟,属樟科,木姜子属,俗称”白茶”,在安徽皖南山区资源丰富,民间饮用历史悠久.其味芳香,性甘凉,具有清凉止渴,解毒消肿,醒神益智,明目健胃,顺气解表,散瘀止痛等功效Ll0j,但其有效部位在治疗糖尿病方面的研究目前尚未见报道.为了认识和了解这一野生植物资源
3、,以便更好的开发利用,本实验主要观察了老鹰茶总黄酮(totalFhvonoidsof/seaCoreana,1FlJC)对糖尿病小鼠和大鼠模型的降血糖作用,并探讨其部分作用机制.1实验材料1.1啊制备老鹰茶采自安徽省宁国县,阴干备用.用12倍量(ww,溶剂体积,药材干重)80%乙醇回流提取3次,每次2小时,提取液浓缩,干燥,所得醇提物加适量水溶解,调pH=2,先用石油醚脱色,再用正丁醇萃取,正丁醇萃取部分精制得黄酮部分(I),余液上大孔吸附树脂柱,先用水洗脱去除水溶性杂质,再用9o%乙醇洗脱得黄酮部分(),合并两部分得到TFLC.总黄酮得率在3%以上,纯度不低于55%.1.2动物普通级昆明种小
4、鼠,雌雄各半,体重1822g;普通级SpagueDawlay(SD)大鼠,雄性,体重200220g;均由安徽医科大学实验动物中心提供.实验中未注明时均指实验前禁食2小时.1.3药物与试剂格列本脲:天津太平洋制药有限公司,批号020907.苯乙双胍:南通制药总厂,批号011017.盐酸二甲双胍片:中美上海施贵宝制药有限公司,批号0303078.盐酸肾上腺素注射渡上海禾丰制药有限公司,批号0212027.四氧嘧啶(一):Sigma公司产品,临用前用生理盐水配制成1%溶液.链脲佐菌素(toc/n,STZ):Sigma公司,临用前用pH4.5的0.1mol/L柠檬酸缓冲液配制成1%溶安徽省教育厅自然科
5、学研究项目No.2oojl9s安徽省高等学校青年教师科研资助计划自然科学项目No.2004jq164安徽医科大学博士科研经费资助计划项目No.)(120D44液.葡萄糖测定试剂盒:上海荣升生物技术有限公司产品.胰岛素放射免疫分析测定盒:北京北方生物技术研究所.TG,rI,LDL,HDL测定试剂盒:上海科华东菱诊断用品有限公司产品.1.4仪器FA2004A电子天平:上海精天天平厂制造.DL一5M低速冷冻离心机:长沙湘仪离心机仪器有限公司产品.722紫外分光光度计:上海分析仪器厂制造.MuhiskanMK3酶标仪:上海雷勃分析仪器有限公司产品.cc一911.y放射免疫计数器:中科大科技实业总公司中
6、加光电仪器公司产品.2实验方法2,1正常小鼠的分组及给药正常小鼠50只随机分为对照组,TFI.C给药组(100,300,900mg?d)及格列本脲给药组(50mg/?d).对照组给予等体积生理盐水(2olll,kg?d),均为灌胃给药,每天1次,连续5天,于末次给药后3小时取血测血糖含量.2.2肾上腺素高血糖模型的建立,分组及给药正常小鼠6o只随机分为正常对照组,高血糖模型组,TFI.E给药组(100,300,900z/l(g?d)及格列本脲给药(50mg/kg?do正常对照组及高血糖模型组给予等量生理盐水,均为灌胃给药,每天1次,连续5天,于末次给药后1小时,正常对照组腹腔注射等体积生理盐水
7、,其余5组均腹腔注射肾上腺素30(0?一,诱导肾上腺素性高血糖模型,于注射后30分钟取血测血糖含量.2.3四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立,分纽及给药正常小鼠6o只,除10只正常对照组外,其余均尾静脉注射1%四氧嘧啶生理盐水(1OOmg/kg)制备糖尿病模型,72小时后(禁食12小时)尾静脉采血测定空腹血糖值,血糖值高于16.7mmol/L者纳人实验,根据血糖水平将高血糖小鼠分为5组,灌胃给药(TnC100,300,9tg/kg?d一,苯L,/gloom.d)或等体积生理盐水,每天1次,连续5天,于末次给药前?120?中国中医药科技2008年3月第15卷第2期Mar.2OO8Vo1.15No.2禁
8、食16小时,末次给药后1小时取血测血糖及血清胰岛素含量.2.4链脲佐菌素糖尿病大鼠模型的建立,分组及给药SD大鼠禁食12小时后腹腔注射链脲佐菌素40ms/ks,72小时后(禁食12小时)尾静脉采血测定空腹血糖值,血糖值高于16.7rural?L者纳入实验,根据血糖水平将高血糖大鼠分为糖尿病模型组,TFLC给药组(100,200,400ms/ks?d)及二甲双胍给药H(200mg/kg?d),每组1O只.另取1O只同批次正常大鼠作为正常对照组.正常对照组及糖尿病模型组给予等体积生理盐水,均为灌胃给药,每天1次,连续14天,于末次给药后3o分钟,取血测定血糖及血脂.2.5测定方法血糖测定:采用葡萄
9、糖氧化酶法.血清TC,TG测定:采用氧化酶法.血清LDLC,HDLC测定:采用直接清除法.血清胰岛素测定:采用放射免疫法.2.6统计学处理数据用均数标准差(s)表示,采用SPSS11.0进行studentt检验.3实验结果3.1TFEC对正常小鼠血糖的影响见表1.表1TFLC对正常小鼠血糖的影响(s)与空白组比较*P<O.05,*P<O.013.2TFEC对肾上腺素性高血糖小鼠血糖的影响见表2.表2TFLC对肾上腺素性高血糖小鼠血糖的影响(s)与正常组比较P<O.05,P<O.01;与模型组比较*P<0.05.*P<0.013.3TFLC对四氧嘧啶糖尿病小鼠
10、血糖及血清胰岛素水平的影响见表3.表3TFLC对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖及血清胰岛素水平的影响(s)O.晒与正常组比较P<0.05,P<0.01;与模型组比较P<3.4TFLC对链脲佐茵素糖尿病大鼠血糖,血脂的影响见表4.表4TFI/2对链脲佐菌索糖尿病大鼠血糖及血脂的影响(s)删n二与正常对照组比较P<O.05,P<O.01;与模型组比较*P<O.o54讨论老鹰茶含有黄酮,苷类,有机酸,香豆素和鞣质等成分,其中黄酮类是老鹰茶的主要成分,主要有山柰酚,山柰酚一3一OpD一葡萄糖苷及槲皮素一3一OpD一葡萄糖苷2.本实验初步研究了TFLC的降血糖作用及部分机理,
11、研究结果表明TFLC能降低正常小鼠的血糖含量,提示其可通过刺激胰岛B细胞分泌胰岛素产生降糖作用.肾上腺素通过分解肝糖原使血糖升高】,而TFIE降低肾上腺素性高血糖小鼠的血糖值,说明其可能具有抑制肾上腺素引起的肝糖原分解和促进肝糖原合成的作用,从而可减少血糖的来源,增加血糖的去路,明显降低代谢异常导致的血糖升高.四氧嘧啶和链脲佐菌素均为胰岛G细胞杀伤剂,可选择性地损伤胰岛B细胞,引起实验性糖尿病.在糖尿病小鼠和大鼠模型中,TFLC具有显着的降糖作用,同时对四氧嘧啶糖尿病小鼠血清中胰岛素的释放也具有促进作用.提示其主要通过保护胰岛p细胞或促进受损p细胞的修复以及促进胰岛素分泌,增加血清胰岛素含量而
12、达到降低血糖的目的.糖尿病是一种常见多发的代谢疾病,常伴有血脂的升高,而糖,脂代谢紊乱与糖尿病慢性并发症的发生发展密切相关.因此降低血脂对于阻止或延缓并发症,改善糖尿病患者的预后具有重大意义.本实验采用小剂量链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,成模2周已出现明显的脂代谢紊乱,模型组的TC,TG,LDL均明显高于正常对照组,而HDL水平显着降低.与有关报道一致【7,经TFLC治疗后TC,TG,LDL均显着降低,HDL水平也显着升高,说明TFLC对糖尿病大鼠血脂紊乱具有一定的调节作用.综上所述,TFEC具有良好的降血糖活性,与阳性对照药磺酰脲类和双胍类均具有相似性.可能是通过直接刺激胰岛B细胞释放胰岛素
13、,保护胰岛p细胞或促进受损p细胞修复,抑制过多内源性肝葡萄糖生成和调节脂质代谢紊乱等多种途径发挥作用,其他可能有关的作用机制如增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗以及对2型糖尿病的降糖调脂作用等有待进一步研究.糖尿病治疗的最终目标不仅是使血糖水平正常化,而且是从根本上纠正代谢紊乱,才能避免并发症的发生,故迫切中国中医药科技2O08年3月第l5卷第2期Mar.2O08Vo1.15N0.2需要对糖尿病及高脂血症等均有防治作用的药物.1nF由于对糖尿病,脂质代谢紊乱均具有较好的疗效,因而具有开发成降血糖新药的前景.本文的研究结果为开发和利用皖南山区老鹰茶提供了一定的科学依据.参考文献1郁建平,叶辉.老鹰
14、茶(豹皮樟)天然食用色素的初步研究.食品科学.2OO2,23(2):40.2郁建平,古练权.贵州老鹰茶的化学成分.植物资源与环境学报,2001,10(3):61.3孙红,宋波,于德伟,等.消渴欣胶囊降血糖作用研究.中药药理与临床,2O05,21(1):37.4S&udelskiT.Themechanism0falloxanandstreptootocinactioninecellsoftheratp1crt.PhyolRes,2001,50(6):537.5FamjM,LuIlL,CianfloneK.Diabetes,lipidsandadipocyteseeretagogues.B
15、iochemCellBiol,2O04,82(1):170.6郝贤,付雪艳.益气养阴活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗及血脂的影响.中国中医药科技,2OO6,13(2):74.7刘莹,朱东屏,徐向进,等.灵菊七提取物对糖尿病大鼠治疗作用的实验研究.解放军药学学报,2OO6,22(4):287.(收稿:2Oo70412)HPLC法测定宫瘤消胶囊中丹皮酚的含量陈大中宗呜王智张瑞(黑龙江中医药大学中医药研究院?哈尔滨l50O4o黑龙江中医药大学第二附属医院?哈尔滨150001)1材料与试药高效液相色谱仪(美国Waters600E一2487),MillenniuH产色谱工作站(美国Waters),丹皮酚(中
16、国生物制品检定所提供,编号:o78o一9704),甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为蒸馏水.宫瘤消胶囊(牡丹皮,牡蛎,制香附,三棱,莪术等):黑龙江中医药大学中医药研究院制备提供.2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,日本岛津SHIMPACK色谱柱(4.6nra250n-al,5/an).流动相:甲醇一水(45:55);流速:1.0ml/min;柱温:30;检测波长:274nm.2.2对照品溶液的制备精密称取对照品丹皮酚4.76mg,加甲醇适量使溶解,并转移至50ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度.2.3供试品溶液制备取本品lO粒,倾出内容物,研细,称取粉末lg,精
17、密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,密塞,摇匀,称定重量,超声处理(300w,频率5ol)30分钟,放冷,再称定重量.用甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密量续滤液5ml,置10ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得.2.4标准曲线绘制分别精密吸取上述浓度的丹皮酚对照品溶液0.25051.0,1.5.2.0,2.5ml转移至10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度.分别精密吸取不同浓度的丹皮酚对照品溶液各20td,注入液相色谱仪,测定峰面积,计算标准曲线,得回归方程:Y=一251.29+2016737.33X(r=0.9997),结果表明,丹皮酚在0.04760.476ptg之间呈良好的
18、线性关系.2.5精密度试验取官瘤消胶囊(批号:20070312)10粒,倾出内容物,研细,取粉末1g,精密称定,按2.3制备供试品溶液,连续测定6次,测得峰面积值,照上述色谱条件测定蜂面积,计算相对标准差RSD:1.33%.2.6稳定性试验精密吸取供试品溶液按2.1色谱条件,按设定时间每次间隔20分钟连续测定6次,计算丹皮酚的峰面积积分值的相对标准差RSD=1.46%.供试品溶液在2小时之内稳定.2.7重现性试验称取同一批号宫瘤消胶囊(批号20070312)供试品6份,取粉末lg,精密称定重量,照2.3制备供试品溶液和测定峰面积,计算平均含量及相对标准差RSD=1.19%,本方法重现性较好.2
19、.8回收率试验取本品官瘤消胶囊(批号20070312)10粒,倾出内容物,研细,取粉末O.3g,精密称定,分别加入丹皮酚对照品O.476mg,混匀,按2.3制备供试品溶液及测定峰面积,计算回收率,结果见表1o表1回收率实验数据表(n=6)2.9样品测定对3批中试样品的含量测定结果见表2.本制剂中以丹皮酚(Hl0()3)计每粒应不低于O.60rag.表2供试品含量测定数据表(n=3)3讨论对不同的提取溶剂进行了实验比较,结果表明以甲醇溶剂干扰最小,提取效果最佳.同时对流动相进行相应的考察,结果以甲醇一水(65:35)为流动相,供试液的分离效果较好,丹皮酚的峰形对称,理论板数较高,故选用甲醇一水(65:35)作为本法流动相.(修回.20070110)