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1、土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选组数：第一组 组员：王臣东 李长花 张晓晶 杨明明1 实验目的1.1掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。1.2进一步掌握和熟练无菌操作技术。1.3掌握分离纯化微生物的方法。1.4掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。1.5巩固以前学的微生物学实验技术。1.6学习淀粉酶活性的测定方法。2 实验原理-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。淀粉酶是能够催化淀粉水解，转化成葡萄糖的、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的总称。从淀粉厂周围采集土壤样品，采用稀释法制备土壤
2、稀释液，涂布于营养琼脂培养基平板上培养1天，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。然后挑取可产生透明圈的菌株在平板划线培养2-3次，得到纯化的菌株，再测其酶活力大小。分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角
3、瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 3 实验器材3.1样品：土样（甘肃昆仑生化公司周围采集的土样若干）3.2培养基3.2.1平板培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g、琼脂15-20g、 自来水1000ml3.2.2斜面培养基：同3.2.13.2.3液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、自来水1000ml3.3 器材：30个90培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌
4、锅、超净工作台3.4试剂3.4.1 淀粉酶活力测定：碘液3.4.2革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇3.4.3 2%淀粉溶液：2克淀粉加入少量热水使其溶解，再加入热水至100ml4 实验步骤4.1 培养基的制备及其仪器的灭菌 4.1.1按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。加少量水熔解,再加入琼脂加热溶化最后补充水分，分装入试管内或三角烧瓶内，加塞包扎。4.1.2 试管中加入4.5ml水，三角瓶中加入玻璃珠和90ml水，将所有待灭菌仪器和培养基用报纸包扎，121， 20分钟高压蒸汽灭菌。 4.1.3搁置斜面及倒平板 将灭菌的培养基冷至50左右，在
5、超净工作台上，试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角瓶中的培养基倒平板，静置待用。4.2 产淀粉酶菌株的分离、纯化4.2. 1采集土壤样本 由于甘肃张掖昆仑生化公司有生产淀粉的车间，所以在其周围有大量产淀粉酶的菌株，然后用小铲子去除5cm表土，取离地面5-15cm处的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，标明时间、地点和环境情况，放在冰箱中保存。4.2.2 稀释称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，至于摇床摇15min，使土样和水充分混合，使细胞分散。用一只无菌吸管吸取0.5ml土壤悬浮液加入盛有4.5ml含有无菌水的试管中充分混
6、匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 几种稀释度的土壤溶液。4.2.3 初步筛选4.2.3.1用稀释样品的不同吸管分别依次从10-7、10-6、10-5、10-4样品稀释液中，吸取0.2mL于冷却凝固的平板上，用涂布棒涂抹均匀。倒置于37温箱中培养24小时。4.2.3.2培养24小时后，取出平板，注入1-2ml碘液，观察其透明圈，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明圈，说明该菌能产生淀粉酶使其水解。4.2.4分离纯化从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的单菌落，用接种环沾取少量菌株采用划平行线法或者三片区域划线法进行2-3次划线分离。
7、A：平行画线法 B：三片区域划线法4.2.5挑取单菌落划线至斜面上，培养24h后保存。4.2.6将上述单菌落进行革兰氏染色观察其形态4.2.6.1涂片、干燥及固定4.2.6.2初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。4.2.6.3媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.2.6.4脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约1520秒，后立即用流水冲洗。4.2.6.5复染：滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干。 4.2.6.6镜检：油镜观察染色结果。4.3 高活力淀粉酶菌株的筛选：4.3.1初筛（点样接种法）4.3.1.1
8、 将上步平板上淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的单菌落用接种环挑取后在新倒的平板上绕其边缘点样，一般点6点。后倒置在37温箱中培养24小时。4.3.1.2 往培养好的平板上滴加碘液观察，用尺子量取淀粉水解圈直径与菌落直径，初选出酶活力较高的菌株。4.3.2复筛4.3.2.1 将斜面上保存的菌种活化后制成10-6菌悬液。4.3.2.2 将制好的菌悬液按体积分数4的接种量接种于装有液体培养基的摇瓶中，编号，摇瓶容量50 mL，装量20 mL，培养温度37，摇床转速120 r / min，培养24h。4.3.2.3 培养好的液体4000 r / min离心20min,取上清液0.2 mL 与1 mL
9、 质量分数1的淀粉溶液于37 水浴5 min，然后沸水浴5 min，终止反应，再加入1 ml碘液，沸水浴5 min后，迅速冷却观察颜色。以空白液体培养基加质量分数1淀粉直接煮沸再加1 ml碘液，反应后作为空白对照。5 注意事项：5.1 液体培养基做好后应该立即灭菌，防止空气或别的杂菌污染培养基。5.2 在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌。5.3 沸水浴后要迅速冷却。5.4 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜5.5 搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。5
10、.6 用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包报纸，用麻绳以活结形式扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。培养皿、移液管、涂布棒用报纸包扎，再用麻绳以活结形式扎好。5.7 试管里面加入45ml自来水，三角瓶里面加入90ml自来水和玻璃珠，加塞，再在棉塞外包一层报纸，其外再用一道麻绳扎好。5.8 划线时接种环在平板上迅速移动，平行线之间的距离要小，使划线次数增加，及时灼烧接种环上剩余的菌体。5.9 平板中加入碘液时要轻轻摇动，以免用力过猛菌落被碘液冲下来。5.10 革兰氏染色时涂片不宜过厚，准确把握脱色时间。6 实验预期结果： 终止反应后观察到的颜色，如果颜色越淡则表示该菌株
11、的产淀粉酶酶活较高，反之则比较低。由于本次实验是由观察颜色来确定最终的实验结果，所以存在误差，应该进行更为精确地实验来确定最终产酶量较高的菌株。另外初筛后可以根据菌落所形成的透明圈大小可以初步判断菌株产酶活力的高低。7 参考文献： 1 罗志刚, 杨景峰, 罗发兴. 淀粉酶的性质及应用 J . 食品研究与研发, 2007, 28( 8): 1- 18.2 沈萍. 微生物学M . 2 版. 北京: 高等教育出版社, 2002: 63- 65.3孙晓菲，李爱江淀粉酶的应用及研究现状畜牧兽医科技信息，（）：赵铭钦，李晓强，王豹祥，等淀粉酶和蛋白酶高产菌株的诱变选育烟草科技，（）：陈远钊，罗俊成，胡佳，等酸性淀粉酶菌株的诱变及酶的性质研究中国酿造，（）：余诗庆，王宇建一种耐高温淀粉酶高产菌株的选育方法淮阴工学院学报，（）：燕卫东贫瘠土壤中淀粉酶产生菌株的筛选中国酿造，（）：王晓红，池振明产淀粉酶海洋酵母菌的筛选及鉴定中国海洋大学学报，（）：郭宏文，冮洁，田明，等酸性异淀粉酶产生菌的诱变育种高师理科学刊，（）：