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1、过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质的影响尤翔宇 黄慧敏 吴伟 吴晓娟（中南林业科技大学食品科学与工程学院 稻谷及副产物深加工国家工程实验室 粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室 特医食品加工湖南省重点实验室 长沙 410004） 基金项目：国家自然科学基金面上项目(31771918)；湖南省教育厅科研项目（17C1667）；湖南省大学生研究性学习与创新性实验计划项目收稿日期：2018-07-17作者简介：尤翔宇，男，1993年出生，硕士研究生，粮油深加工通讯作者：吴伟，男，1981年出生，教授，粮油深加工通讯作者：吴晓娟，女，1984年出生，工程师，粮油深加工.摘 要 采用不同浓度的
2、2,2-盐酸脒基丙烷（AAPH）有氧热分解产生的过氧自由基氧化米糠蛋白，研究过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化和消化产物抗氧化性质的影响。结果表明：随着AAPH浓度的增加，米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率和初始消化速率先上升后下降，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大值；过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物中分子质量分布在5001500 u 的肽含量呈现先上升后下降的趋势，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大值25.19%。随着AAPH浓度的增加，过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物清除ABTS+、DPPH、OH和O2的能力以及金属螯合能力、还原能力均先上升后下降，最大
3、值均出现在AAPH浓度为1 mmol/L时。结果表明过氧自由基轻度氧化可提高米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率和消化产物的抗氧化性，而过度氧化则降低米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率和消化产物的抗氧化性。.关键词 过氧自由基 米糠蛋白 蛋白质氧化 体外消化 抗氧化性质中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1003-0174（ ） - -.米糠是糙米加工为精米过程中产生的主要副产物，主要由稻谷的果皮、糊粉层、亚糊粉层、种皮、珠心以及少量胚乳构成，米糠占稻谷质量的10%左右1。米糠是蛋白质的良好来源，全脂米糠中一般含有12%-16%的蛋白质，脱脂米糠中一般含有15%-20%以上的蛋白质，米糠蛋白具
4、有较好水溶性、低过敏性以及独特的生理活性，是一种极具开发潜力的优质谷物类食品蛋白质2。目前全球每年大约90%的米糠用作饲养牲畜和家禽的廉价饲料，剩余10%左右用于加工米糠油，这主要是由于米糠中含有12%-24%的脂肪和活性极强的脂肪酶，使得米糠极易酸败变质1。米糠水解酸败产物使得米糠毛油酸值迅速升高，从而增加米糠油精炼过程中的脱酸难度和成本3；米糠氧化酸败产物可导致米糠蛋白氧化，使得米糠蛋白的结构特征、理化性质和消化性质发生改变4，从而影响米糠蛋白的营养品质。.蛋白质氧化会导致必需氨基酸的损失，降低食品蛋白的营养5。相比蛋白质氧化对必需氨基酸损耗的研究结果，氧化对蛋白质消化性的影响则一直备受争
5、议，不同氧化体系、不同氧化程度以及不同来源食品蛋白的消化性结果往往大相径庭6。此外，不同食品蛋白质的结构柔性差异以及体外消化模型中不同蛋白酶识别与催化位点差异也使得氧化蛋白消化速率和消化程度的变化复杂化7-8。米糠氧化酸败产物主要包括脂质自由基和活性脂质氧化产物，这些活性物质都具有氧化米糠蛋白的能力4， 2,2-盐酸脒基丙烷(2,2-azobis(2-amidinopropane)，AAPH)有氧热分解产生的过氧自由基可代表米糠氧化酸败产物中最主要的自由基中间体9。因此，本研究采用AAPH在有氧条件下热降解产生的过氧自由基代表米糠氧化酸败中产生的脂质自由基，研究脂质自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋
6、白酶消化性质和消化产物抗氧化性质的影响，为深入研究米糠蛋白营养品质提供理论依据。.1 材料与方法1.1 材料与试剂新鲜米糠（酸价小于4 mg KOH/g油，稻谷品种为籼稻中嘉早17）：湖南长沙霞凝国家粮食储备库；AAPH（纯度：97%）：上海Macklin公司；胃蛋白酶（900 U/mg）：Biosharp公司；肽分子质量标准品（细胞色素C（12 384 u）、抑肽酶（6 511 u）、杆菌肽（1 450 u）、氧化型谷胱甘肽（651 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg （451 u）、Gly-Gly-Gly（189 u）、1-二苯基-2-苦肼基（1, 1-diphenyl-2-picryl
7、hydrazyl radical，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2, 2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）：美国Sigma-Aldrich公司；其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。.1.2 仪器与设备Sorvall LYNX 6000高速落地离心机：美国Thermo Fisher公司；FD5-4冷冻干燥机：美国GOLD-SIM公司；色谱柱TSKgel SW G2000 SWXL(300 nm7.8 nm) ：东曹（上海）生物科技有限公司；LC-20液相色谱仪：日本岛津
8、公司；Blue Star紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份公司。.1.3 方法1.3.1 米糠蛋白提取参考何莉媛等4方法提取米糠蛋白。新鲜米糠除杂过40目筛，随后与正己烷以1:5（g : mL）料液比混合脱脂，重复脱脂五次。将脱脂米糠和去离子水以1:10（g : mL）混合，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，在40 、120 r/min下搅拌提取4 h，随后以8 000 r/min在4 下离心20 min，取上清液用2 mol/L HCl调pH至4.0，静置20 min后在4条件下以8 000 r/min离心20min得到米糠蛋白沉淀，水洗米糠蛋白沉淀3次后将沉淀分散于5
9、倍体积的去离子水中，用2 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，采用截留分子质量3 500 u 的透析袋透析24 h脱盐，最后冷冻干燥得到纯度为83.75%的米糠蛋白。.1.3.2 过氧自由基氧化米糠蛋白的制备参考Wu等10方法制备过氧自由基氧化米糠蛋白。将米糠蛋白分散于0.01 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液（含有0.5 mg/mL NaN3）中，配制成蛋白浓度10 mg/mL的溶液。将一定质量的AAPH溶解于米糠蛋白溶液中，使得AAPH浓度分别为0、0.1、1、3、6和10 mmo1/L，然后将混合液在37避光条件下振荡反应24 h。随后将反应液置于冰浴中降温至4 以下，再将溶
10、液在4 去离子水中采用截留分子质量3 500 u 的透析袋透析24 h，除去残余未反应的AAPH，最后冷冻干燥得到过氧自由基氧化米糠蛋白。.1.3.3 过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化程度的测定参考何莉媛等4方法。将米糠蛋白溶解于去离子水中配置成质量分数为2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl调节pH值到2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37 下保温酶解1.5 h，沸水浴5 min终止消化，10 000 r/min离心10 min后取上清液，取部分上清液凯氏定氮，剩余上清液配制成0.6 mg/mL的酶解液，用于测定米糠蛋白胃蛋白酶消化产物分子质量分布和抗氧化性。.1.3.4 过氧自
11、由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的测定参考何莉媛等4方法。将米糠蛋白溶解于去离子水中配置成质量分数为2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl调节pH值到2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37 下保温酶解，分别酶解0、5、10、20、30、40、60、90 min后加入终浓度为15%的三氯乙酸终止反应，随后在4 、8 000 r/min条件下离心15 min，取上清液测量在280 nm处OD值。为表征米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程，参考Bax等11方法引入拟合指数曲线方程和半衰期方程：. 式中：ODmax为消化完全时稳定的最大OD值；为描述曲线形状系数；t1/2表征达到0.5倍ODmax所
12、需的消化时间。.1.3.5 米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物分子质量检测参考Chen等7方法。将肽分子质量标准品：细胞色素C（12 384 u)、抑肽酶（6 511 u)、杆菌肽(1 450 u)、氧化型谷胱甘肽（651 u)、Gly- Gly-Tyr- Arg (451 u）、Gly- Gly- Gly（189 u）分别分散于流动相中，配制成蛋白浓度1 mg/mL的溶液；将1.3.3中得到的上清液配置成浓度相同的溶液。随后将标准品和样品过孔径0.22 m的醋酸纤维素膜，收集滤液。采用高效液相色谱仪对样品进行分析，以标准品分子质量对数值与相应保留时间作标准曲线。色谱柱：TSKgel SW G200
13、0SWXL(300 nm7.8 nm)；检测器：紫外检测器；流动相：0.1 mol/L、pH 6.8含0.1 mol/L Na2SO4的磷酸盐缓冲液；检测波长：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：25 。.1.3.6 过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物抗氧化能力的测定参考何莉媛等4方法测定过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物清除ABTS+、DPPH、OH、O2的能力以及金属螯合能力、还原能力。.1.3.7 数据处理与统计分析所有实验平行测定3 次。数据采用Microsoft excel 2003和Origin 7.5进行处理，结果用平均值标准差的形式表示。指标比较采用
14、最小显著差异法，取95%置信度（P0.05）。.2 结果与分析2.1 过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率的影响尤翔宇等12研究不同浓度AAPH（0、0.1、1、3、6和10 mmo1/L）有氧热分解产生的过氧自由基氧化米糠蛋白的氧化程度，发现随着AAPH浓度的增加，米糠蛋白羰基、二硫键、二酪氨酸含量持续增加，表明米糠蛋白逐渐氧化。不同浓度AAPH处理的米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率如图1所示，当AAPH浓度1 mmol/L时，随着AAPH浓度的增加，米糠蛋白消化率逐渐增加，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大值35.01%；当AAPH浓度1 mmol/L时，米糠蛋白消化率逐渐下降，并
15、且低于空白对照组（0 mmol/L AAPH）。表明过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率与米糠蛋白氧化程度有关，当蛋白质氧化程度较低时，过氧自由基氧化可提高米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率，当蛋白质氧化程度较高时，过氧自由基氧化则降低米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率。.Zhou等8在氧化亚油酸-猪肉肌原纤维蛋白氧化环境、Sun等13-14在广式腊肠加工氧化环境以及Feng等15在羟自由基-乳清分离蛋白氧化环境研究得到的蛋白质体外消化率随蛋白质氧化程度的变化趋势与本文类似。Zhou8等认为低浓度氧化亚油酸可导致猪肉肌原纤维蛋白暴露更多的胃蛋白酶结合位点，从而导致低氧化程度的猪肉肌原纤维蛋白体外消化率上升
16、。Sun等13-14认为广式腊肠加工过程中的过度氧化环境使得猪肉肌原纤维蛋白和肌浆蛋白变性和聚集，过度氧化形成蛋白质氧化聚集体由于空间位阻作用而影响蛋白酶识别底物结合和催化位点，从而降低猪肉肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的消化率。Feng等15认为羟自由基轻度氧化可增强乳清分离蛋白结构柔性，从而提高体外消化率；羟自由基过度氧化形成的蛋白质聚集体形成的空间位阻影响蛋白酶作用于蛋白质酰胺键，从而降低乳清分离蛋白消化率。此外，吴伟等16在研究米糠酸败影响碱性蛋白酶酶解米糠蛋白性质时发现，随着米糠贮藏时间的延长，米糠蛋白氧化程度逐渐增加，米糠蛋白在碱性蛋白酶催化下的水解度先增加后下降，并认为米糠短期贮藏使得碱
17、性蛋白酶水解度增大是由于轻度蛋白质氧化使得米糠蛋白结构部分展开，从而暴露出更多易于被碱性蛋白酶识别和酶解的位点；米糠长期贮藏使得碱性蛋白酶水解度下降是由于过度蛋白质氧化使得米糠蛋白形成共价交联的氧化聚集体，从而降低碱性蛋白酶与米糠蛋白的识别和接触位点。因此，轻度蛋白质氧化可诱导蛋白质空间结构部分去折叠，蛋白质结构柔性增加，从而提高蛋白质对蛋白酶的敏感性；过度蛋白质氧化可使得蛋白质发生共价交联，形成大量蛋白质氧化聚集体，从而降低蛋白质消化率17。尤翔宇等12在前期研究过氧自由基氧化对米糠蛋白结构影响时发现，当AAPH浓度较低时（1 mmol/L），米糠蛋白氧化程度较低，二级结构中-螺旋和-折叠含
18、量变化幅度很小，氨基酸残基侧链含量逐渐增加，表明低浓度AAPH可诱导米糠蛋白结构部分展开；当AAPH浓度较高时（1 mmol/L），米糠蛋白氧化程度较高，-螺旋含量下降和-折叠含量增加幅度显著，形成较为明显的蛋白质氧化聚集体，并且二硫键和非二硫共价键共同参与米糠蛋白氧化聚集体的形成。由此可见，不同氧化程度米糠蛋白结构特征的这种差异性变化是造成不同浓度AAPH降解形成过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率变化的原因。.图1过氧自由基氧化对米糠蛋白胃蛋白酶消化率的影响注：同一柱状图中不同字母表示有显著性差异（P0.05）。下同。2.2 过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的影响过氧自由基
19、氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程如图2所示，消化进程拟合曲线的参数见表1所示。随着AAPH浓度的增加，ODmax先增加后下降，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大值0.229；半衰期t1/2先下降后上升，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最小值14.25 min。以半衰期t1/2对应的OD280值计算出初始消化速率OD280/h，如图3所示，随着AAPH浓度的增加，米糠蛋白体外胃蛋白酶初始消化速率先上升后下降，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大值。Sun等13和Zhou等8在研究蛋白质氧化程度与蛋白质初始消化速率、半衰期的关系时也发现与本文相似的变化趋势。Sun等18认为轻度
20、蛋白质氧化可导致隐藏在蛋白质内部的疏水基团暴露出来，从而提高蛋白酶消化速率。Zhou等8研究发现蛋白质轻度氧化导致大豆蛋白肽链伸展，蛋白质结构柔性增加，从而提高消化速率；蛋白质过度氧化形成的聚集体则降低大豆蛋白消化速率。尤翔宇等12研究发现低浓度AAPH热降解产生的过氧自由基可导致米糠蛋白结构部分展开，而高浓度AAPH热降解产生的过氧自由基则会氧化修饰米糠蛋白形成聚集体。由此可见，米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率变化的原因是不同氧化程度导致米糠蛋白空间结构出现不同的变化。.图2 过氧自由基氧化对米糠蛋白胃蛋白酶消化进程的影响表1 过氧自由基氧化对米糠蛋白胃蛋白酶消化进程拟合曲线参数的影响AAPH(
21、mmol/L)1/ODmaxODmaxt1/2/minR20 5.470.18311.4716.550.970.1 5.150.19410.4315.050.961 4.370.2299.8814.260.993 7.120.14012.0717.410.986 8.370.11912.1017.460.9710 10.650.09412.5918.160.98图3 过氧自由基氧化对米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率的影响2.3 过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物分子质量分布的影响凝胶色谱柱TSK-GEL G2000 SWXL标准曲线如图4所示，根据标准曲线得到过氧自由基氧化米糠蛋白胃蛋白酶
22、消化产物分子质量分布结果如表2所示。米糠蛋白胃蛋白酶消化产物分子质量分布大多集中在01500 u之间，与徐亚元等18采用碱性蛋白酶水解米糠蛋白得到的短肽分子质量分布类似。随着AAPH浓度的增加，米糠蛋白胃蛋白酶消化产物中分子质量小于500 u的短肽含量逐渐下降，分子质量分布在5001500 u 的短肽含量先上升后下降，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大值25.19%。.图4 分子质量分布标准曲线表2 过氧自由基氧化对米糠蛋白胃蛋白酶消化产物分子质量分布的影响分子质量/u所占比例(%)0 mmol/L AAPH0.1 mmol/L AAPH1 mmol/L AAPH3 mmol/L AA
23、PH6 mmol/L AAPH10 mmol/L AAPH050060.9859.6558.9458.7558.2858.04500150020.2221.4925.1920.2015.2413.99150030005.304.453.722.193.494.26300080006.825.524.105.408.558.9480006.6810.8912.0513.4614.4414.772.4 过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物抗氧化性的影响过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶酶解产物抗氧化性如表3所示，随着AAPH浓度的增加，米糠蛋白体外胃蛋白酶酶解产物清除ABTS+、DPPH、
24、O2、OH能力和金属螯合能力以及还原能力均先上升后下降，并且都在AAPH浓度为1 mmol/L时均达到最大值，最大值分别为48.17%、28.14%、39.82%、42.26%、37.31%、0.322。Zhou等8研究氧化亚油酸浓度对猪肉肌原纤维蛋白体外蛋白酶消化产物抗氧化性质影响时发现，当氧化亚油酸浓度较低时（0.5 mmol/L），猪肉肌原纤维蛋白体外蛋白酶消化产物氧化自由基吸收能力逐渐增加；当氧化亚油酸浓度较高时（0.5 mmol/L），猪肉肌原纤维蛋白体外蛋白酶消化产物氧化自由基吸收能力逐渐下降，与本文米糠蛋白体外蛋白酶消化产物抗氧化性和蛋白质氧化程度之间的变化趋势类似。.蛋白质酶解
25、产物的抗氧化性与抗氧化肽的分子质量分布密切相关。Abavominp等19在分离纯化米糠蛋白体外胃蛋白酶酶解产物中抗氧化肽时发现，米糠蛋白酶解产物中抗氧化性较强的肽分子质量分布主要集中在5001800 u之间。佟立涛等20在研究大米蛋白体外消化产物抗氧化活性时发现，大米蛋白体外消化产物中抗氧化活性较强的肽分子质量分布主要集中在1811000 u。由此可见，米糠蛋白体外模拟消化得到的抗氧化活性较强的肽分子质量分布可认为在5001500 u之间。随着AAPH浓度的增加，表2中米糠蛋白胃蛋白酶消化产物分子质量分布在5001500 u 的肽含量变化趋势和米糠蛋白胃蛋白酶消化产物抗氧化性变化趋势完全一致，
26、并且米糠蛋白胃蛋白酶消化产物分子质量分布在5001500 u 的肽含量与其消化产物抗氧化性6个指标线性相关方程的R2均大于0.90（线性相关性没有列出），因此，可认为米糠蛋白胃蛋白酶消化产物中抗氧化性较强的肽分子质量分布在5001500 u之间。.表3 过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃消化产物抗氧化性质的影响 AAPH浓度/ mmol/L清除ABTS能力/%清除DPPH能力/%清除O2-能力/%清除OH能力/%金属螯合能力/%还原能力037.941.84c23.040.46c30.010.24c33.430.45c30.620.64c0.3050.003b0.141.040.74b24.160.
27、16b34.060.51b37.730.16b34.470.91b0.3020.009b148.171.88a28.140.42a39.820.65a42.260.20a37.310.78a0.3220.007a334.420.44d22.530.31c26.600.23d33.070.44c28.360.23d0.2830.002c632.030.91e20.730.10d22.660.17e30.580.41d26.180.16e0.2500.012d1028.511.29f19.670.17e15.150.33f28.620.17e23.520.73f0.2170.015e注：同一列肩标
28、中不同字母表示在5%水平上显著差异3 结论通过构建过氧自由基氧化应激环境，探讨过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质和消化产物的抗氧化性质的影响。过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率和初始消化速率均先上升后下降，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大值35.01%、0.48 OD280/h。通过检测过氧自由基氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物的分子质量分布，发现AAPH为1 mmol/L时分子质量分布在5001500 u 的短肽含量最高。消化产物清除ABTS+、DPPH、O2和OH的能力以及金属螯合能力、还原能力均先上升后下降，在AAPH浓度为1 mmol/L时达到最大，最大值分别
29、为48.17%、28.14%、39.82%、42.26%、37.31%和0.322，结果表明过氧自由基适度氧化提高了米糠蛋白的消化率和消化产物的抗氧化能力，过氧自由基过度氧化严重制约米糠蛋白的消化率和体外胃蛋白酶消化产物的抗氧化性。本论文研究结果为揭示米糠酸败过程中的蛋白质氧化对米糠蛋白营养品质影响提供理论参考，下一步应采用动物实验评价米糠酸败过程中的蛋白质氧化对米糠蛋白营养品质的影响。.参考文献1 GUL K, YOUSUF B, SINGH A K, et al. Rice bran: nutritional values and its emerging potential for de
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44、 Central South University of Forestry and Technology, National Engineering Laboratory for Rice and By-product Deep Processing, Hunan Key Laboratory of Grain-oil Process and Quality Control, Hunan Key Laboratory of Processed Food for Special Medical Purpose, Changsha 410004).Abstract Effects of oxida
45、tive modification by 2,2-azobis(2-amidinopropane) (AAPH)-derived peroxyl radicals on in vitro pepsin digestibility of rice bran protein and antioxidant activity of rice bran protein hydrolysates were investigated. The results indicated that as AAPH concentration increased, pepsin digestibility and i
46、nitial digestion rate of rice bran protein firstly increased, and then decreased, pepsin digestibility and initial digestion rate of rice bran protein reached the maximum value as concentration of AAPH was 1 mmol/L. The content of peptides with molecular weight distribution of 500 1500 u in the pepsin digestion products of peroxyl radicals modified rice bran protein firstly increased, and then decreased, and reached the maximum of 25.19% as the concentration of AAPH w