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1、项目四、SHMT的电泳制备,任务一、SHMT的电泳制备方案的制定,樊贝贝 第二组 生药1111 2011423105,1、概念 中文简称：“丝氨酸羟甲基转移酶” 英文名称： Serine hydroxymethyltransferase 简介：它是酶促制备L-丝氨酸的关键酶，在四氢叶酸(THFA)、甲醛及磷酸吡哆醛(PLP)存在下催化甘氨酸生成L-丝氨酸。它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换。,一、知识链接,2、电泳方法根据支持物的不同，可以分为纸电泳，薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 3、酶工程领域中采用较多的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 4、
2、影响电泳的因素： 电泳介质的PH值， 缓冲液的离子强度， 电场强度， 电渗现象。,5、SHMT在光合组织中的生理作用 （1） 光合作用组织中线粒体GDCSHMT系统在Gly和Ser分解中起着重要作用 （2） SHMT在非光合组织中的生理作用 （3)SHMT在根瘤碳流动中的作用 （4）光呼吸SHMT影响植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力,6、SHMT的分离制备的方法 电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳) 定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离目的的分析方法,7、电泳作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 作用原理： 聚丙烯酰胺凝胶
3、为网状结构，具有分子筛效应。 8、电泳形式： （1）非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。,垂直板电泳槽示意图,加样,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺Acr和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺Bis聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。 Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。,二、实训
4、原理,化学法的引发剂是过硫酸胺Ap催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。,1、试剂 分离胶缓冲液（Tris-HCL缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。 浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:
5、称取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。,30AcrBis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。 TEM10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；7%冰乙酸溶液。 染色液：称取考马斯亮蓝R250 2.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454 ml使其完全溶解，过滤ED；后置棕色瓶保存。 脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。,2、材料 SHMT标准蛋白质 3、器材： 垂直板型电泳槽、天平、 直流稳压电源、 50或
6、100l微量注射器、 玻璃板、水浴锅、 染色槽、 烧杯、吸量管 胶头滴管,1、 安装垂直板电泳槽 （1） 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠； （2） 用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板； （3) 用蒸馏水试验封口处是否漏水。,2、制备凝胶板 （1） 分离胶制备： 取Acr-Bis储备液 5.0mL, Tris-HCl缓冲液 PH8.9 2.5mL, 去离子水12.39mL, TEMED 0.02mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度
7、距样品模板梳齿下缘约 1cm。,用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约34cm），用于隔绝空气，使胶面平整。 分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。,（2） 浓缩胶制备： 取Acr-Bis储备液1.0mL， Tris-HCl 缓冲液（PH6.7）1.25mL，TEMED 0.01mL, 去离子水7.64mL，10% 过硫酸胺0.1mL，用磁力搅拌器充分混匀。 混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板。,用手夹住两块玻璃
8、板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。 插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。,3、加样 （1) 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.51mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。 (2) 一般加样体积为1015L（即210g蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。 (3)用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳,4、电泳 （1）将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分
9、离较时，将电流调至2030mA。 （2）当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。,5、染色 将凝胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。 6、脱色 弃去染色液，将凝胶置于脱色液中，并经常更换脱色液，直至背景蓝色褪去。如用50水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。,(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。 (2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 (3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。,五、注意事项,(5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。 （6）为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。 （7）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。,谢谢观看,