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1、。实验二苹果中多酚氧化酶最适pH的测定一、实验原理存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变。 因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜离子的酶， 它能催化两类不同的反应。 一是一元酚羟基化， 二是邻 - 二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同时催化这两类反应；而在另一些植物中，多酚氧化酶仅能催化邻 - 二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。如果采用邻 -二酚作底物， 那么随着酶催化反应进行， 反应混合物的吸光值因邻 - 苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。二、试剂和仪器试剂： 0.2
2、mol/L醋酸 -醋酸钠缓冲液， pH 分别为 3.6 、4.0 、4.6 、 5.0 和 5.6 、0.2mol/L磷酸盐缓冲液， pH 分别为 6.0、6.5 、7.0 、7.5 和 8.0 、0.01mol/L儿茶酚溶液、 0.05mol/L磷酸盐缓冲液， pH=6.5 、丙酮仪器：组织捣碎机、抽滤装置、721 分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器、离心机三、实验步骤1、从苹果中萃取多酚氧化酶将 100 g 苹果迅速去梗和核后切成小块， 和 400mL 左右预先冷冻至 26 的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（20,000rpm ，2 min ），然后迅速抽滤，保留滤纸上的沉淀部分，
3、将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去，至沉淀无丙酮味。将所得丙酮粉转移至150 mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（ pH 6.5 ）中，搅拌 30min ，然后离心（ 4 ,10000 r/m,20 min），离心所得上清液如有混浊，则用8-可编辑修改 -。层纱布过滤，从而得到多酚氧化酶提取液。2、不同 pH 下多酚氧化酶活力的测定在比色皿中分别加入1.81.1 mL pH为 3.6 的缓冲液和 0.7mL 儿茶酚溶液，搅匀后加入 0.51.2mL多酚氧化酶提取液，迅速搅匀，测定反应混合物在400nm 下的吸光值随时间的变化， 参比以缓冲液代替酶液。 依次测定 4.0、4.6 、5.0 、5.
4、6 、6.0 、6.5 、 7.0 、7.5 、8.0 几个 pH 。四、数据记录与处理数据记录：pH 值3.64.04.65.05.66.06.57.07.58.0加酶量1.01.2（ mL ）10 OD值0.1720.1660.1600.1500.1470.1150.1060.1300.1600.151（12s（12s（ 12s（ 15s（ 11s（11s）20 OD值0.2140.2040.2100.1940.1490.1150.1070.1320.1620.15130 OD值0.2580.2500.2580.2400.1520.1150.1090.1340.1630.15140 OD值
5、0.3000.2950.3020.2960.1560.1170.1080.1350.1650.15250 OD值0.3410.3380.3480.3290.1610.1170.1100.1360.1660.15360 OD值0.3820.3770.3920.3730.1660.1180.1110.1370.1700.15470 OD值0.4200.4180.4330.4150.1710.1210.1130.1390.1730.15680 OD值0.4570.4560.4750.4550.1750.1230.1170.1430.1750.15890 OD值0.4940.4940.5140.496
6、0.1790.1260.1180.1430.1780.161100 OD值0.5290.5300.5540.5340.1860.1270.1200.1450.1820.164110 OD值0.5650.5670.5910.5720.1880.1300.1210.1510.1840.165120 OD值0.5980.6010.6260.6070.1920.1330.1240.1510.1880.168用 Excel 处理数据，得到不同 pH下消光 - 时间曲线的斜率，斜率的物理意义即-可编辑修改 -。每分钟增加的消光值，也即酶的活力单位数。-可编辑修改 -。-可编辑修改 -。数据处理：pH 值3
7、.64.04.65.05.66.06.57.07.58.0加酶量1.0mL1.2mL酶活力0.23280.24100.25400.24980.02640.01020.01020.01140.01550.0098-可编辑修改 -。酶活 mL 0.23280.24100.25400.24980.0220.00850.00850.00950.01290.0082用 Excel 作图得到下图：由酶活力 -pH曲线关系可以得知苹果中的多酚氧化酶在pH=4.6时的酶活力最高，也就是说pH4.6 是苹果中多酚氧化酶的最适pH 。五、讨论1、苹果中存在着多酚氧化酶的天然底物，因此在制备多酚氧化酶提取液的过程中，快速和低温是必要的条件，否则将得到褐色的酶液。2、丙酮可使酶蛋白沉淀下来，从而与天然底物分离，但是常温下丙酮会导致酶变性，因此必须先冷却至 26 。事实上，在试验中，丙酮并没有冷却到 26 ，因此匀浆时现取现用。3、本实验所测酶活较低，可能有两个原因，一是所选的两个苹果有一个是红苹果不是酶活相对高点的青苹果；二是在通风橱里用吹风机吹去丙酮时，所吹的风不是冷风，二是带有温度的热风，导致酶有些许的失活所致。-可编辑修改 -