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1、2020年蛋白提取方法（课件） 材料和方法 11 材料 .1 组织和细胞的来源:1.12 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 （0,0g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 。1。试剂 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫苏糖醇 (T） 尿素 CHAPS PSF ETA乙醇磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A亮肽素 试剂纯度均应是分析纯或以上.1.1。4溶液配制 (1) BS： NCl 8g， KCl 。2 g,a2PO444 ， K2O，溶于00 ml水中，用HCl调pH至74，用纯水定容至1;(2） ED 储存液: 1.61 gNaEDA2H2O,溶于0ml纯水中，用10 olLNa
2、O调节H值至8.0 (约需2NOH颗粒），定容为10 l。可高压灭菌后分装备用； （) 亮肽素储存液 （50 g/ml,100） 10 mg/ml溶于水，-75保存；使用时配成 /l储液,-20保存; （4）抑肽素储存液（70 g/ml,100） g/m溶于甲醇,7保存；使用时配成0 g/ml储液,-20保存;（5) 储存液（1 m， 1)： 。4 mMF,溶于1ml异丙醇中，20 保存。 TT储存液（1 M）: 0.31 gDTT溶于 ml H中，20保存 （T或含有DT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌）。(7) 裂解液： ysis buffr A (9M ea，4 /v CH, 1 w/
3、TT, 0. A and a ocktail of protease nhitor）Lysiufe B(7 M uea， 2tioura， 4 w/v CHAP， w/v DT，0.5 CA d a cockil potea ihibio）Lysi uffer C 4 mM Trib（p .5) in ultrpure Lsis ue D（ M ua， CHAPS, 0 mMTris(bae）, 0 l）Lsis ufferE （5 Mure， M hiurea,2 SB310,% CHAP， % /v TT，0。CA ad a ctai of potease ihibitrs）Lyis bf
4、er F100 L SDS samplesouion （w/v SDS, 0.75 M TrisC，pH。， 50 mMDT， 25% vgycero)CA、蛋白酶抑制剂混合物和TT在临用前加入。蛋白酶抑制剂混合物3成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物MSF3 g/mor 1 mMDA0.mgml ( M) 抑肽素0。 g/ml亮肽素0。5 g/ml1。方法 1。1。1组织蛋白提取方法1211三氯醋酸/丙酮沉淀法 （）冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步； (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织； （3）将粉末悬浮于含D（0。2%w/）的10%三氯醋酸(w/v）的丙酮溶液中； （4）
5、蛋白20沉淀过夜; （5）3000g（)离心min； 将沉淀重悬于含%DTT的预冷丙酮中； （7）2放置1;300(）离心3mn；（9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀;(0)在裂解液中重新溶解沉淀(50mg组织需要1ml裂解液）; (1）15，000g，离心1;(12）用Brafo法测定上清的蛋白浓度，分装后置75保存。121.超速离心法（1）取材； (2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每1g样品加入0.5ml裂解液,使用组织匀浆器匀浆30s；(3)组织悬液15,1000g离心10i； (4）上清液4，150000g超速离心45； （5）小心避开上层漂浮的脂质层,吸取离心上清
6、640,000再次离心5m； 取离心上清。Bafod法定量,分装后置75保存.122培养细胞蛋白提取 1.2。1循环冻融法 ()吸出培养液弃去，01mol/LPS洗一次; (2）加入PB，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中； （3）50g，离心5min; （4)弃上清,PBS洗三次（室温,500，5mn)， (5)在离心管中加入1lPB,重悬细胞,用1ml微量加液器移入Eppendorf管中；执行Biofuge存储程序8,505离心； (7）用00l微量加液器吸出BS，弃去;吸干残留的B，估计样品体积，加入倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s，室温融化），DTT在第
7、一次冻融后加入； (9)执行Biofug存储程序6，15,400g，离心1hr（iouge); （1)上清radfrd法定量，沉淀-75保存备用. .2.2超声破碎法 （1）取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去,。01ml/S洗一次； （2）加入PB,用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中; （)室温，50，离心5i； （4)弃上清,PBS洗3次（室温,0，5min）;(5）在离心管中加入mlPBS，重悬细胞,用1微量加液器移入Eppe管中，50g离心5mn； 吸干残留的PS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液，混匀,移入15lEppendrf管中,冰浴中以最大功率超声破碎细胞（10s); （）,40
8、0g,离心hr（Biog）； 上清Bradford法定量,沉淀保存备用。 2结果和讨论蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。 我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便,比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度,即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性,同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小,所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实
9、验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法；由于神经组织比较柔软,液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如BckanL765超速离心机的离心管容量为l,不适用小量样品的制备。 在众多的裂解液配方中,我们主要采用M尿素，4w/AP，1vTT,0。5两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用,高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度,尿素就容易析出，影响蛋白的溶解），过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。早期我们加入Trs碱以防止蛋白的水解,但是由于盐离子的引入,导致IF电压过低,影响聚焦. .感谢您的阅览以及下载，关注我，每天更新7 / 7文档交流