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1、利用MTT法测定不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖作用的抑制效果摘要：采用MTT法测定不同浓度的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil ，5-Fu）对宫颈癌Hela细胞增殖作用的抑制效果，发现5-氟尿嘧啶对Hela细胞的增殖抑制基本上呈量效依赖关系。不同浓度的5-氟尿嘧啶对宫颈癌Hela细胞的生长均有一定的抑制作用。5-氟尿嘧啶的化疗剂量在50 150 ug/ml之间时，既可以得到较高化疗的效果, 又可以尽量减少副作用。关键词：MTT法、5-氟尿嘧啶、Hela细胞、抑制前言：近年来，宫颈癌的化学治疗越来越受到国内外的重视，5-氟尿嘧啶作为DNA抑制药物常用于临床宫颈癌的治疗,
2、 其作用机理为通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，从而抑制DNA的生物合成。由于肿瘤患者对不同剂量化疗药物的敏感性差异较大, 且化疗药物具有毒副作用。因此, 治疗肿瘤的化疗药物敏感剂量的筛选对指导临床用药, 提高疗效, 减轻毒副作用等具有重要意义。在多种体外抗癌药物筛选方法中, MTT法是近年来备受推崇的检测方法1。我们通过用不同浓度的5-氟尿嘧啶作用于体外培养的宫颈癌Hela细胞, 用MTT法检测其抑制率, 对实验结果进行分析，寻找最佳的治疗剂量。1. 材料和方法1.1 材料Hela细胞株、5-氟尿嘧啶、胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) 、96 孔细胞培养板、新生牛血清、CO2
3、细胞培养箱、酶联免疫检测仪、多用途振荡器。胰蛋白酶消化液用Hanks液配制成浓度为0. 25%溶液；MTT用PBS液配制成浓度为5mg/ml溶液；培养液应用灭菌蒸馏水、新生牛血清配制成含10%血清的细胞培养液,分别用0. 22m的微孔滤器除菌, 4保存。1.2 方法1.2.1 消化用0.25%的胰蛋白酶消化经传代稳定生长并且生长状态良好的贴壁Hela细胞,并用含10%新生牛血清的培养液吹打、配成均匀的近似单个细胞的悬液。1.2.2 计数细胞计数板计数后,用含10%新生牛血清的培养液调整细胞悬液的细胞浓度约为5104个/ ml，再稀释为约为2.5104个/ ml、1.25104个/ ml、0.6
4、25104个/ ml，用于制作细胞浓度曲线；另调整为23104个/ ml，用于接种于药物处理。96 孔板，每孔加入细胞悬液200 uL，使每孔内的细胞数约为5000个。1.2.3 接种将稀释制备好的Hela细胞悬液以每孔200L接种于96孔培养板中,每一浓度4个平行孔。共设置1个空白对照组(1行,无细胞的含10%新生牛血清的培养液)，在2到6行中分别添加200L 5104个/ ml、2.5104个/ ml、1.25104个/ ml、0.625104个/ ml的Hela细胞悬浮液，用于制作细胞浓度曲线。在第8到12行添加200L23104个/ mlHela细胞悬浮液。1.2.4 培养细胞将接种完
5、成的96孔细胞培养板移入CO2培养箱中,在37、5% CO2 及饱和湿度条件下进行培养。1.2.5 药物处理 在培养液内加入5-氟尿嘧啶，配成以下8组不同的5-氟尿嘧啶实验药物浓度梯度：A组为1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml；B组为20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml；C组为40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ug/ml；D组为50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml；E、F组均为75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml,G组为200ug/ml、400ug/
6、ml、800ug/ml、1600ug/ml；H组为300ug/ml、600ug/ml、900ug/ml、1500ug/ml；Hela细胞在培养箱内培养24h后，吸出原培养液，加入以上不同浓度的5-氟尿嘧啶药物培养液，每空添加200uL，每个浓度接种4孔作重复实验。换液后继续放回CO2培养箱中培养。1.2.6 对照设置：本实验设置调零组（只加培养液、MTT、二甲基亚砜），1组对照组（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）。1.2.7 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ ml的MTT溶液20 uL，CO2培养箱中培养4 h，终止培养：快速翻转培养板，弃去孔
7、内培养上清液；然后每孔加DMSO 150 uL，振荡30min，使结晶物充分溶解。1.2.8 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。2. 结果全部利用Microsoft Excel进行分组处理 (表中每一数值=每浓度4孔的测定平均值-空白组测定平均值)。细胞存活率=（实验组OD 值）/（对照组OD 值）100%;细胞增殖抑制率=（对照组OD 值-实验组OD 值）/对照组OD 值 100%。若该值为正说明药物对细胞增殖具有抑制作用，若值为零表明对细胞增殖无影响；若值为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。测量结果如表格1所示，另外，B组、C组因为被细菌感染，故舍弃
8、。 表格1 不同浓度梯度的5-氟尿嘧啶对Hela细胞的影响组别浓度（ug/ml）光密度（OD）值存活率（%）抑制率（%）A组对照11010010000.5550.4070.2220.1460.13073.3340.0026.3123.4226.6760.0073.6976.58D组对照501002004000.7450.2750.2180.190.17336.9129.2625.5023.2263.0970.7474.5076.78E组对照751503006000.3270.1020.0830.0830.08031.1925.3825.3824.4668.8174.6274.6275.54F组
9、对照751503006000.4140.2290.1970.1360.16955.3147.5832.8540.8244.6952.4267.1559.18G组对照20040080016000.4750.2850.2610.2460.25660.0054.9551.7953.8940.0045.0548.2146.11H组对照30060090015000.4720.2820.2580.2430.25359.7554.6651.4853.6040.2545.3448.5246.403.分析：3.1 从表格1可以看出，不同浓度的5-氟尿嘧啶作用于宫颈癌Hela细胞72h后, 均呈现出对Hela细胞
10、增殖活性的不同程度抑制，在每一组浓度梯度中，随药物浓度的增加,呈现存活率逐渐降低,而抑制率逐渐增加的趋势。3.2. 从表中我们还可以看出，不同的组别中相同5-氟尿嘧啶药物浓度处理的Hela细胞的抑制率也有很大的波动，原因为每组由不同的人员进行操作，在进行细胞稀释、计数、加样等的操作中会引入较多的实验误差，影响实验的正确性。因此，在实验的过程中，要注意规范操作，充分考虑一些可能引起误差的的一些细节。另外，8组实验中有两组被细菌污染，同样也说明在细胞体外培养过程中,样本的防止细菌污染是成功的关键操作之一。3.3 通过计算每个组内的方差可以发现，D组方差在六个组内是最高的，R2 = 0.7313；E
11、组的方差次之，R2 = 0.4806。再对以上六组数据做折线散点图分析（如图一所示），发现A、D、E 三个组的折线都比较集中，趋势比较一致，而且和彭勤等的实验2结果比较吻合。综合考虑上述的三点，所以认为A、D、E三个梯度组的实验误差比较少。 图1 不同浓度梯度的5-Fu对Hela细胞生长的抑制3.4 我们挑选实验误差比较少的A、D、E三个梯度实验组的数据制作折线散点图进行综合分析 (如图二所示) ，可以发现，10 ug/ml以上的的药物浓度对Hela细胞具有较好的抑制作用，彭勤等的实验也得出25g/ ml的5-氟尿嘧啶对Hela细胞的抑制率达到55.62%2。150 ug/ml以上的的药物浓度
12、对Hela细胞的抑制作用增加不明显。对于临床应用来说，当药物浓度达到150 ug/ml以上时, 其抑制率不再明显升高, 反而给机体带来更强的各种毒副作用，显然是得不偿失的。所以临床应用中使用50 150 ug/ml之间的药物浓度为宜，在这个浓度范围内，既可以对Hela细胞有较高的抑制率，又可以尽量减少对人体的伤害。4讨论4.1 MTT法是一种检测细胞存活与生长的方法,广泛应用于细胞系的体外抗癌药物筛选。在MTT比色分析中, 单细胞悬液制备、细胞存活率、细胞接种量、药物剂量及作用时间均可影响肿瘤细胞的药物敏感性。据细胞生物学研究, MTT法的作用原理是哺乳类动物类活细胞线粒体内膜中的呼吸链上的琥
13、珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子,染料MTT作为脱下氢原子的接受剂, 被还原成蓝紫色的甲攒结晶（Formazan）,通常情况下Formazan生成量与活细胞数量成正比。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的Formazan，因此用酶联免疫监测仪在490nm或570nm测定其光吸收值，能间接反映细胞的数量。具有代谢活性的细胞, 无论处于静止期, 还是分裂期, 都有还原MTT的作用, 还原程度与细胞活性有关。血清是细胞生长不可缺少的成份,但血清对MTT实验结果有影响, 因为血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀,影响透光度。为了减少血清的影响,MTT前尽量去掉培养上清3。 4.2 由图二可见, 5-
14、氟尿嘧啶对Hela细胞的增殖抑制基本上呈量效依赖关系, 提示临床用药时, 在患者可以在耐受的前提下, 可适当提高药物浓度，但药物浓度控制在50 150 ug/ml之间的药物浓度为宜，在这个浓度范围内，既可以对Hela细胞有较高的抑制率，又可以尽量减少对人体的伤害。而高于150 ug/ml的剂量时, 其抑制率不再明显升高, 反而给机体带来更强烈的各种毒副作用。 为进一步探究抑制Hela细胞的最适宜的剂量，可以设计5-氟尿嘧啶的实验浓度梯度为25、50、75、100、125、150、175ug/ml。从以上六个组的实验结果可以看出，A、D、E组中5-氟尿嘧啶浓度大于等于200 ug/ml时，其抑制
15、率与150 ug/ml浓度的抑制率相比，没有显著的差异（P0.50.05）。 1 Mosmenn T1Rap id colorimetric assay for celluLar growth and survival;app lication to p roliferation and cytotoxicity assays1 mmunol Methods,1983, 65 (1) : 552 彭勤，彭惠，骆云鹏，汤为学 MTT 比色法测定药物对HeLa 细胞作用的实验研究 现代妇产科进展2000 年第9 卷第5 期3 赵承彦 ,靖志安,牛青霞 MTT显色反应实验条件分析 河南医学研究 2000年6月 第9 卷第2 期