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1、2020年测定蛋白酶活力实验（课件）测定蛋白酶活力实验一、实验目的.加深了解酶活力的概念.2。学习掌握测定蛋白酶活力的方法。二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1 酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Flin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比. 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化
2、，可计算出蛋白酶的活力.三、仪器和试剂仪器：恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.0o/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡1分钟，使充分溶解，干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.试剂1. Folin酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠（2Wo4 . 2H2O）10g，钼酸钠（NaW. 2H2O）25g,蒸馏水00mL，5磷酸0L 以及浓盐酸100L,充分混匀后,微火回流加热1小时。再加入硫酸锂15g,蒸馏水5mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴
3、。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤,溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度（约为2mo/L),然后加水稀释至1m，即可使用.0.2mol/L 盐酸溶液30.04mo/L氢氧化钠溶液40。5mol/L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0molLp7。5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2PO4 12H2O)7。6g，用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠（Na2HP4 .2H2）3.1,用水定容至0mL(B 液)。取A 液84mL，液6mL混合后，得到02mol/LpH7.磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。7。 标准
4、酪氨酸溶液（50g/mL）：称取5g以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2o/L 盐酸约0m 溶解后，蒸馏水定容至50mL。8。 酪蛋白溶液(0）：称取1.5g酪蛋白,用0.4mo/ 氢氧化钠溶液（20m）溶解,再用02mol/pH75磷酸缓冲液定容到20m。四、操作步骤（一)酪氨酸标准曲线的制作取6支试管(标号0，15）,按顺序分别加入.0，0。0，0.40，0。60，0。80和10mL 标准酪氨酸溶液,再用水补足到100mL，摇匀后各加入0.55ml/ 碳酸钠。0mL，摇匀。依次加入Foin酚试剂1.0m，摇匀并计时,于30水浴锅中保温1min.然后68nm 处测定吸光值（以0号管作对照).以酪氨
5、酸含量（)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。（二）酶活力测定1。酶反应：取一支试管,加入2.0L0.5%的酪蛋白溶液,于0水浴中预热5分钟,再加入1。mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液,立即计时,水浴中准确保温0min,从水浴中取出后,立即加入。L的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟,干滤纸过滤，收集滤液（样品液）.另取一试管,先加入10L已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0m 的0%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟,再加入.0mL0。%的酪蛋白溶液，然后于3水浴保温1n，同样干滤纸过滤,收集滤液（对照液）。以上两过程,应各做一次平行实验.滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管,分别加入.0mL 水、A 液、B 液,然后各加入5。0 mL 0.5molL 碳酸钠溶液和0mLoln酚试剂,摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值,由标准曲线查出A、B液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。五、计算A 样品样品液的吸光度值 对照对照液的吸光度值K标准曲线上A=1时对应的酪氨酸g数V酶促反应液的体积（本实验为mL）T酶促反应时间（本实验为10m）N酶溶液稀释倍数. .感谢您的阅览以及下载，关注我，每天更新4 / 4文档交流