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1、乳酸菌的分离与发酵实验生命科学学院2009级四班2组傅盛晟摘要：本文对乳酸菌的分离与发酵实验进行阐述，从市售酸乳中分离保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并进行分离与鉴定，最后进行酸乳的发酵实验！实验主要是分离与纯化，鉴定与发酵，最后用分离的菌进行酸乳发酵在与市售酸乳混合菌种进行比较。关键词：酸奶，乳酸菌，分离鉴定，发酵微生物在厌氧条件下，分解己糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要能利用可发酵糖生产乳酸的细菌，即乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobaterium)和明
2、串珠菌属(Leuconostoc)等。乳酸细菌多是耐氧菌，只在厌氧条件下才进行乳酸发酵，所以在筛选乳酸茵或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。酸奶是以全脂牛奶等为原料，经乳酸细菌发醇而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发醇制品，是具有一定保健作用的食品。酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽由此促进了球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌还产生了双乙酰这类风味物质，因此，达到了稳定状态的彻合发酵。酸乳发酵的基本原理是通过乳酸细菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中的酪蛋白(在全乳中的质量分数为29，在
3、乳蛋白中的质量分数为85)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可以形成酸奶特有的风味和香味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其PH降至酪蛋白等电点(4.6)附近(4.04.6)从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酷蛋内降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和丁二酮等风味物质。这就是酸奶具有良好的保健作用和适合广大乳糖不耐症患者饮用的主要原因。按凝固状态可将酸奶分为搅拌型酸奶和凝固型酸奶，两者工艺过程基本相似，本实验主要是凝固型酸奶的制作方法。一， 材料与方法1. 材料和用具1） 菌种，嗜热乳酸链球菌，保加利
4、亚乳酸杆菌，这两类菌种可从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。2） 培养基 参照相关文献和老师的建议以及乳酸菌生长需要复杂营养物质和多种生长因子，我们选用如下培养基：分离纯化培养基： 脱脂乳平板培养基鉴定培养基：脱脂乳试管其他：脱脂乳粉或脱脂牛奶，蔗糖等3） 仪器及用具 恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，试管，三角瓶若干2. 培养条件培养温度：40厌氧条件：由于乳酸菌的发酵与分离纯化都需要厌氧条件，而实验室没有专门的厌氧培养箱，所以我们采用在培养皿和发酵杯上套上保鲜膜制造无氧环境。培养时间：在培养基上分离培养的时间为2天左右，酸乳发酵为12个小时左右方法和步骤1）乳酸菌的分离
5、纯化 (1)分离。取市售新鲜酸乳或泡菜的酸液稀释，取其中的、2个稀释度的稀释液各0.10.2mL，分别接入脱脂乳琼脂培养基上，用无菌玻璃刮铲依次涂布，或者直接用接种环沾取原液，平板划线分离，置40下培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落及其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。 (2)鉴别。选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40培养824h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞呈杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色阳性，则可将其接种到试管斜面上连续传代46次，最终选择出在36h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 2）乳酸菌饮料酸乳的发酵 (1)将全脂乳粉和水按质量比为1
6、：(710)混匀，或将新鲜牛奶灭菌后，加入质量分数为5、6的蔗糖，充分混合，于8085灭菌1015min，然后冷却至3540，备用。 (2)将分离到的嗜热乳链球菌、保加利亚乳杆菌及两种菌的等量混合菌用接种环蘸去加入调配好的已经灭菌的一次性塑料杯子中，搅拌匀，随后用保鲜膜封住杯口。 (3)将接种后的酸乳瓶置于4042恒温箱中培养34h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。再转入45的低温下冷藏24h以上进行成熟。 (4)以品尝为标准评定酸乳质量，将用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳受杂菌污染了。二、实验实际操作结果1
7、.平板画线分离结果2.分离涂布结果继续纯化（1）形态特征 ：分离乳酸菌革兰氏阳性，不运动、不形成芽孢和荚膜，大小均在标准范围之内。乳杆菌茵体大小0.51.01.5 6 .0m，杆状，菌体钝圆，单在或呈链状存在。嗜热链球菌大小0，7 1 m，球形或卵圆形，多成双，也可呈长链状存在。（2）培养特性：在脱脂乳平板培养基上培养 2天后。干酪乳杆菌及嗜酸乳杆菌菌落一般 13mm大小、圆形、边缘整齐表面光滑中度隆起、灰白色或淡黄色。保加利亚乳杆菌菌落 l3mm大小，两面凸起，星形状。嗜热链球菌形成点状茵落。在脱脂乳平板培养基上培养 2天后，三种乳杆菌均为无色的羊毛状粗糙的小点状菌落。 嗜热链球菌为 l 2
8、mm大小，光滑微白色有光泽、两面凸起的菌落。3.脱脂乳鉴定及镜检结果由平板划线分离培养基上选取的1、2、3号菌种均能使脱脂乳试管凝固（见上图），分别对其进行革兰氏镜检呈阳性，细胞杆状或链球状，鉴定为所要菌种，进行斜面接种纯化镜检结果：4.斜面接种结果5.酸乳发酵结果混合菌发酵后牛奶单菌发酵后的牛奶表 乳酸茵单菌及混合菌发酵的酸乳品评结果 乳酸菌类品评项目结论凝乳情况口感香味异味pH值乳球菌部分凝乳较差较差有异味单菌发酵酸乳凝固情况较差，为了口感和凝固较好最好用混合菌发酵！乳杆菌部分凝乳较差较差有异味乳球菌与乳杆菌混合（1:1）牛乳基本全部凝乳，凝乳较好甜味和酸味适中较好无三、讨论及结论 在实验
9、中开始我们没有采取厌氧措施，结果导致培养分离的培养皿上杂菌较多，镜鉴后只有极少量的乳酸菌。后来我们采用保鲜膜覆盖培养基制造厌氧环境才培养分离到了较好的乳酸菌种，并经镜鉴和发酵最终做出了和市场销售酸乳风味差不多的酸乳。因此在乳酸菌的分离纯化与发酵过程中保证厌氧环境是十分重要的，不必拘泥于传统的实验造作要灵活运用已有材料才能取得良好的结果。分离乳杆菌和链球菌进行的混合发酵，比使用单一菌株进行发酵时产酸快，产酸性能稳定，凝固均匀，无乳清析出，芳香风味好，说明乳制品发酵过程中使用混合乳酸菌发酵剂是应该提倡的。【参考文献】1 张以芳，刘阴武等. 酸奶与酸奶饮料中乳酸菌的分离鉴定及发酵性能试验 J2 黄秀梨 辛明秀 微生物学试验指导 M 高等教育出版社 2008