小鼠胚胎干细胞衍生的肝组织微粒体Ⅱ相代谢酶表征.docx

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1、第42卷第5期浙江大学学报(医学版) Vol 42 No 52013年JOURNAL 0F ZHEJIANG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES) 2013http：wwwjoumalszjueducnmedDOI：103785jissn1008_9292201305009小鼠胚胎干细胞衍生的肝组织 微粒体相代谢酶表征李彤1，郭美媛1，马葵芬12，杜悦1，何良艳1，朱丹雁1，楼宜嘉1(1浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所，浙江杭州310058；2浙江大学医学院附属第一医院药剂科，浙江杭州310003)摘要 目的：观察小鼠胚胎干细胞定向分化肝组织过程中，肝组织微粒体相代谢

2、酶尿苷-5 二磷酸葡醛酰转移酶(UGT)1a1、1a6和微粒体谷胱甘肽S转移酶1(mGSTl)的表达及其催化活性。 方法：利用拟胚体固有的三胚层结构，直接由中胚层心肌细胞产生成纤维细胞生长因子，自发诱导 内胚层细胞发育，并由同步分化的内皮细胞支持肝细胞发育形成肝样组织。在不同分化阶段，基于 mRNA表达情况，以westem blot法检测uGTlal、uGTla6和mGsTl表达特征。至分化终点(第18 天)以心肌细胞搏动区域附近表达肝特异性标记物白蛋白确定为肝细胞。超声法碎裂细胞，超速 离心制备肝细胞微粒体，以HPLC检测uGTs代谢活性，以色谱法测定并计算mGSTl酶催化活性。 结果：至分

3、化终点，小鼠胚胎干细胞衍生的肝组织表达uGTlal、uGTla6和mGSTl，并具有 UGTlal、UGTla6和mGsTl的催化功能。其中分化第18天肝组织GSTl催化活性为765 nmolmin-。mg。结论：小鼠胚胎干细胞分化的肝组织具UGTlal、UGTla6和mGSTl代谢功能，可望 成为肝脏病理生理和药物相代谢研究的体外模型。关键词胚胎干细胞；肝解剖学和组织学；谷胱甘肽转移酶；微粒体，肝；葡糖醛酸基转移酶 中图分类号 R 7421 文献标志码 A文章编号10089292(2013)05053008Characteristics of microsomalphase metaboli

4、cenzymes in mouseembrvoIlic stem ceUderived liver tissueLI Ton91，GUO Meiyuanl，MA Kuifenl”，DU Yuel，He Liangyanl，ZHU Danyanl，LOU Yijial(1，瑚iu把Q厂肌口胤口co锄，7如如。锄。蒯Biocem如口f骱口r僦ceu纽，coZf咿Q厂鼢。肌口ceMt记oZ Sciew，玩彬。增踟劫e您妙，肌哔oM 310058，现in口；2死e见耶4历玩甜舶印i磁，劢咖。昭i睨巧妙Sc00Z矿讹d记i聊，正cz础on 3 10003，C讫i凡口)AbstIIactObjective

5、：110 investigate the characteristics of phase metabolic enzymes in mouseembryonic stem(ES)ceUderived liver tissue Methods：Mature hepatocytes were diffbrentiated from收稿日期：201211-21修回日期：2013m5-20 基金项目：国家自然科学基金重大研究计划资助项目(91229124)；浙江省自然科学基金重点项目(Lzl2H31001)； 浙江省重点科技创新团队基金(2010R50047) 作者简介：李彤(1989一)，女，博士

6、研究生，主要从事干细胞技术与非可控性炎症恶性转化调控网络研究；Email：11319038zjueducn 通讯作者：楼宜嘉(1953一)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事干细胞与转化医学、心脑血管与肝脏药理、药物 毒理学领域研究；Email：yijialouzjueducn万方数据第5期 李彤，等小鼠胚胎干细胞衍生的肝组织微粒体相代谢酶表征embryonic stem cells in cultured mouse embryoid bodies(EB)at d1 8Westem blot was used to detect the expression of uridine 5一di

7、phosphate ducronosyl tmnsferase(U(汀1 a1，u(汀1 a6)and microsomal glutathione Jstransferases 1(mGSTl) during the difkrentiation courseThe derived liver tissue was incubated with UDPGA and 7一HFC，the fo咖ation of 7一HFC glucumnide was detected by HPLC to examine the total activities of UGTl a1 and UGTl a6F

8、urthe咖orethe micmsomes were incubated withCDNB and GSH，and the mGSTl activity was measured by spectrometryReslllts：An increase tendency of UGTl a1 expression was noticed during the differentiation courseUGTl a6 and mGSTl were not detected in the earlier stage until d18 of diffbrentiationThe metaboli

9、c activity of mGSTl in the derived hepatocytes was 765 nmoLminmg on d18 Condusion：711le ES cellderived liver tissue possesses partial metab01ic function of phaseenzymes on d18 of difkrentiation，which might be used as a model for流移iro research on hepatic pathophysiology and phasedrug metabolismKey wo

10、rdsEmbryonic stem cells；“veranatomy&hist0109)r；Glutathione transferase；Micmsomes， “ver；GlucumnosyltransfbmseJ zhejiang univ(Medical Sci)，2013，42(5)：530-537 胚胎干细胞可在体外定向分化为外、中、内网有较高分布，可催化GSH与亲电子基等结合胚层的任何类型细胞。利用拟胚体(embryoid 而加速排出H“。bodies)固有的三胚层结构，直接由中胚层心肌 通过胚胎干细胞定向分化而来的成熟肝组 细胞产生成纤维细胞生长因子，自发诱导内胚织体外研究系统

11、具有很好的白蛋白分泌功能和 层细胞发育，并由同步分化的内皮细胞支持肝 氨降解功能，而且分化成熟的肝组织可在体外 细胞发育形成肝样组织 。三胚层结构可通 培养体系中存活45天以上，其稳定的代谢功能 过细胞因子和信号网络有序地相互诱导分化成 优于原代肝细胞和其它永生化肝细胞系。1。 肝细胞，重演体内肝脏的发育过程，分化所得肝 此系统已被成功应用于药物P4如酶代谢研究， 细胞具有体内正常肝细胞的特征和功能J。 但有关其微粒体相代谢酶研究报道较少。本 因此，胚胎干细胞体外分化衍生的肝组织在肝 研究在已获小鼠胚胎干细胞衍生肝组织微粒体 脏发育研究、药物代谢、药效和毒性研究、肝脏 相代谢酶基因转录1基础上

12、，进一步探讨了 衰竭细胞治疗和组织工程应用等领域的研究前 胚胎干细胞向肝组织定向分化过程中，相代 景备受关注。谢酶uGTlal、uGTla6和mGsTl蛋白表达和催 相代谢酶主要分布在肝脏，其种类繁多，化活性，旨在证实分化所获成熟肝细胞的相应 相代谢酶催化的结合反应是肝脏解毒功能的 相代谢功能，为进一步构建体外肝脏病理生重要途径之一，它可催化外源性物质通过与葡理模型-891或药物相代谢模型提供依据。 萄糖醛酸、谷胱甘肽等结合反应，使之极性加大1材料与方法而排出体外，因此在药物代谢中具有极其重要的作用。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 11材料小鼠胚胎干细胞D3系(胚胎干细 (uridine 5一di

13、phosphate glucumnosyl transferase， 胞D3)购自美国标准生物品收藏中心 uGTs)是存在于细胞内质网的糖蛋白，可催化 (Amedcan Type Culture Collection)。NIHJ、鼠 药物等与葡萄糖醛酸结合，形成葡醛酸苷，后者 体质量分别为雄性(222)g、雌性(202)g， 是药物与内源性物质结合反应最重要的形 由浙江省医学科学院动物中心提供，清洁级，动 式旧J。微粒体谷胱甘肽S一转移酶1(microsome 物合格证号22旬010014。glutathione Stransfemse，mGSTl)在肝细胞内质 12细胞支持培养万方数据浙江大

14、学学报(医学版)第42卷121 原代小鼠胚胎成纤维细胞制备取孕 8个拟胚体，孵育45 h，使吸附贴壁后，每孑L 第13天小鼠断颈处死，去除胚胎头部、内脏及 中缓慢加入1 m1分化培养液，此时开始用倒置 四肢，将躯干部置于盛有DHanks液的培养皿 显微镜每天观察胚胎干细胞向肝细胞分化的形 内，洗2次后，剪成1 mm3的碎块，移至离心管， 态变化。将拟胚体转移至24孑L板内记为第0 加025胰蛋白酶，置37水浴轻轻搅动，孵 天，隔天换细胞培养液1次。育10 min消化，静止5 min后，吸上清液置另一 133细胞体外分化为肝组织免疫荧光成像 离心管中，加入小牛血清终止消化。按此反复 确认参照文献

15、7-9。 消化多次，离心收集细胞，加入小鼠胚胎成纤维 134细胞体外分化为肝组织白蛋白分泌功 细胞培养基(高糖DMEM，01 mmoLL B巯基 能测定采用EuSA法测定不同分化时相细 乙醇和10新生小牛血清)制成单细胞悬液， 胞培养液中白蛋白含量，以考察分化肝细胞是 细胞计数，以4104细胞cm2的密度种至培养 否具备成熟肝细胞白蛋白分泌功能。21。 瓶中，放入5二氧化碳孵箱内孵育。每天或 14Westem blot法检测酶表达 隔天换液，细胞铺满后即传代或冻存。 141总蛋白提取用细胞铲刮取法收集分122饲养层细胞制备取铺满皿底的第3 化过程不同时间点的拟胚体，分别用冰浴中预 至5代小鼠原

16、代小鼠胚胎成纤维细胞，弃去旧 冷的PBS洗涤2次，加入冰上预冷的RIPA裂 培养液，加入含丝裂霉素C 10斗gm1的小鼠胚 解液(1PBs，1NP240，05脱氧胆酸钠， 胎成纤维细胞培养基，孵育1 h，使细胞失去增 01sDS，Triton 100，临用前加入10 mmoLL 殖能力(丝裂霉素c母液：2 ml丝裂霉素c溶 PMSF，1斗gml抑肽酶，2 mml亮抑酶肽)，冰 于5 ml无菌PBs，用铝箔包裹。4可贮存2浴中反复吹打放置30 min，13000g，4离心 周，使用时稀释至终浓度10m1)。弃培养 30 min。取上清液即为蛋白液，用Lowry法作 液，用D-Hanks液洗5次，

17、加人胰酶消化适度， 蛋白定量检测，定量分装后存放一80备用。 离心后制成单细胞悬液，以10104细胞cm2 142Westem blot法检测取蛋白40g上 的密度种至用明胶包被的培养瓶中，放入5 样于125SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳约2 h； 二氧化碳孵箱内培养24 h后使用。蛋白电转膜到硝酸纤维素膜上，约15 h；用123胚胎干细胞支持培养胚胎干细胞按 5的脱脂牛奶溶液于室温封闭1 h，TPBS(添 一定密度接种于饲养层细胞之上，置5二氧 加001Tween)漂洗3次；分别加入兔抗鼠 化碳孵箱中培养。每天换液，23天传代1 uGTlal、uGTla6和mGSTl抗体(1：1000)室温 次

18、。所用培养液为高糖DMEM，o1 mmoLL p 孵育2 h过夜，TPBS漂洗3次；加入辣根过氧 巯基乙醇，非必需氨基酸，106 uL白血病抑制 化物酶标记的抗兔二抗(1：5 000)室温孵育 因子和10胎牛血清。2天传代1次。 15 h，TPBs漂洗3次；采用EcL法检测印迹13胚胎干细胞体外分化为肝组织培养膜，在暗室内压片。条带密度用Gel Doe2000131悬滴培养将胚胎干细胞用胰蛋白酶型凝胶成像系统分析。以BActin为内参照， 消化制成细胞密度为2104个ml的单细胞悬Quantity 0nelM 422(BioRad)软件分析条带。 液，以30恤l接种于10 cm的培养皿盖内表面

19、 15HPLc检测肝组织uGTs代谢活性 上，培养皿内加入10 ml D_Hanks液，然后小心151HPLc色谱条件不锈钢反相色谱柱： 盖上皿盖，使盖内小滴倒挂成悬滴(每个悬滴ZORBAX ODSC18(46250 mmoLL)。流动 约含600个胚胎干细胞)，置培养箱中培养5天相A：001 moLL磷酸二氢钾(pH 3o，o5三 成拟胚体。分化培养液为高糖DMEM，含01 乙胺)，流动相B：90乙腈，经045 mmoLL mmoLL B一巯基乙醇，非必需氨基酸和20胎孔径滤膜过滤，负压脱气30 min。程序洗脱A： 牛血清，不含白血病抑制因子。30o7 min；程序洗脱B：65815 mi

20、n，15132贴壁培养在显微镜下以吸管将拟胚min终止。紫外检测器，入=325 nm。流速1 体转移到用明胶包被的24孑L板内，每一个孔置 mLmin。柱温25。万方数据第5期 李彤，等小鼠胚胎干细胞衍生的肝组织微粒体相代谢酶表征152样本预处理收集胚胎干细胞、分化第 162 mGSTl活性测定 取15 ml离心管，18天肝组织细胞及原代肝细胞，置于冰上，加 加入094 ml缓冲液(01 mo杪L磷酸钾缓冲 适量PBS，用细胞超声仪破碎3 s，冰上静置1 液，pH 65，含05ton x一100)，分别加入 min，反复操作lo次以形成细胞匀浆，用lowrry 250 mmolL GSH20斗

21、l和50 mmoLL CDNB 20 法测定蛋白含量。取04 mg总蛋白于EP管 山，混匀，加入20斗l样品(试验管)，或者20卜l 内，加入终浓度氯化镁10 mmoLL，丙甲菌素10 样品缓冲液(对照管)，混匀后取200斗l，测定 “ml，7一HFC 01 mmoLL，50 mmoLL TrisHCl 340 nm吸光度(A瑚)的变化，每隔20 s测1 (pH 74)加纯水至200斗1。反应前，37水浴 次，共测定2 min。预热3 min，加入终浓度为25 mmolL UDPGA 酶活性的计算方法：第80 s的A(自发反开始反应，37水浴孵育一定时间后，用等体积应的速率)和第20 s的A猢

22、(自发反应和酶促 的冷乙腈终止反应，涡旋，静置10 min后， 反应的总速度)的差值为酶促反应速率，记作13000 xg离心10 min。取上清液，20恤l进样， A。酶的催化活性计算公式为：A96酶蛋峰面积定量。 白量。产物的摩尔吸光系数为96 mm01L叫153代谢产物HPLC检测色谱行为以细 cm。每次测定的值进行直线回归，每个样 胞匀浆上清液作空白样本，在上述色谱条件下，品测定3次，取均值作最后的测定结果。 与含标准品7一HFC葡醛酸苷空白样本经样本2结果处理后进样。7一HFc代谢产物的保留时间(t。)为(6601)min。 21拟胚体心肌细胞发生支持分化肝细胞形154 标准曲线制备

23、于空白样本中加人不 态特征悬滴培养5天的胚胎于细胞通过重力 同量的7一HFC葡醛酸苷标准储备液(250斗g 作用聚集成拟胚体。拟胚体贴壁培养后向四周 ml乙腈液)，配制成系列质量浓度为025、05、 铺展分化生长，铺展分化2天出现搏动区域，第125、25、50、100、200和300斗gml的7一 8天在搏动区域出现囊样结构，囊内为前体肝 HFc葡醛酸苷，按上述样品处理过程分析，以 细胞，随着细胞分化，肝细胞体积增大，呈圆形 不同浓度(C)相对应的峰面积(A)进行回归处 或不规则多边形，排列紧密，核大而圆，位于细 理。在025300斗gml范围内响应值与7一 胞中央(图lA)。第18天免疫荧光

24、成像证实囊 HFC代谢产物浓度成线性关系，回归方程为：A 内细胞为分化成熟肝细胞，白蛋白阳性染色为=33717C+13584(r=09998)。 红色(图B)，光镜下肝细胞附近呈节律搏动区155回收率、精密度和最低检测限用空白 域为分化成熟心肌细胞(图1C)，肌钙蛋白阳性 样本准确配制质量浓度为25、100和200 染色成绿色(图1D)。 斗gm1的7一HFC葡醛酸苷标准液，一日内按标 22肝细胞分化过程中白蛋白分泌变化测准曲线同法测定，并计算上述3个浓度的方法 定不同分化时相细胞培养上清液中白蛋白含回收率和日间精密度。在信噪比(sN)为3 h、 量，以考察分化过程白蛋白表达发育依赖性，及 最

25、低检测限为3125 ng时样品中最低检测限 分化终点是否具备成熟肝细胞白蛋白分泌功 浓度为15。625 nml。 能。结果显示，分化第8天上清液出现微量白16色谱法检测肝组织mGSTl代谢活性 蛋白，随着肝细胞进一步定向分化，白蛋白含量161 制备微粒体取胚胎于细胞与分化第 逐渐增加，第18天达平台期，提示表型分化成18天肝组织，加入5倍容积025 moLL蔗糖，熟的肝细胞同时具有分泌白蛋白功能(图2)。 匀浆。4，10 000g离心15 min，取上清液超 23 胚胎干细胞分化过程中UGTs表达变化 速离心，4，100 000g离心1 h，取沉淀物重 在胚胎干细胞分化为肝细胞过程中UGTl

26、a1 悬于等体积Tds1211HCl(O15 moLL，pH 蛋白表达呈稳定上升趋势；UGTla6在分化初80)超速离心同上。沉淀物重悬于20 ml 025 期未见表达，至分化第18天有较高表达，提示moLL蔗糖混悬后，调整总量为27 ml。 在肝细胞分化过程中UGTs表达逐渐成熟，在万方数据浙江大学学报(医学版)第42卷A：光镜下囊内成熟肝细胞呈不规则椭圆形连接成片；B：肝细胞特异性标志物白蛋白阳染呈 红色并与核(DAPI阳染呈蓝色)很好叠加；C：光镜下肝细胞附近呈节律搏动区域；D：搏动区域心 肌特异性标记物肌钙蛋白DAPI阳染成绿色并与核很好叠加(400)图1 小鼠胚胎干细胞分化至第18天

27、免疫荧光成像确认成熟肝细胞Fig1 Positive immunonuorescence image of confi珊ed mature hepatocllrtes derived frommouse ES cells on dav 1824 分化成熟肝细胞UGlrs的代谢活性 分 化第18天，样品HPLC色谱图显示，在7-HFC 峰t。=(15201)min前出现一个峰面积 较大、分离度较好的代谢产物峰t。=(66士01)min，见图4。据上述反应结果，在相同反应系统中，前40 min内，7-HFC代谢产物生成迅速，且与时间 图2胚胎干细胞细胞分化肝组织过程上清基本呈线性，确定反应时间10

28、 min，其它条件不 液白蛋白分泌量变化(n=3)变比较不同细胞来源的UGTs酶活力。在确定Fig2 Albumin production in the culture 了HPLC条件和反应体系的条件后，取胚胎干 medium during the hepatic diffbren- 细胞、分化第18天肝组织及成熟肝细胞3种不 tiation course f南m mouse ES cells f厅 同样本在体系中反应10 min后，进行UGTs酶=3、的活力检测。在测定UGT酶活力前，先确定酶 活力测定体系中7一HFC代谢产物生成随反应分化第18天表达明显，但表达丰度明显低于成 时间的变化，

29、以确定在最佳反应时间(呈一级 年小鼠肝细胞(图3)，与本课题前期RT-PcR 速率)下进行酶活力测定。实验结果显示，分 结果 相吻合，推测该现象与测试样本夹杂非 化第18天肝组织测定体系中7HFC代谢产物 成熟肝细胞有关。 生成随反应时间逐渐增加，在反应起始阶段万方数据第5期 李彤，等小鼠胚胎干细胞衍生的肝组织微粒体相代谢酶表征tm-n二二二碣j!56基本呈平衡状态，见图5。kD7一HFC代谢产物急剧生成，在120 min时反应864208642OI-IlII暑亡谜蛏程牡纂龋艇u山H卜胚胎干细胞分化肝细胞培养第18天，从细胞总一EbEBU8U18AL分化阶段 蛋白中提取的UGTs浓度是2 mg

30、IIll。产物7-HFC葡糖苷酸的变化通过RPHPLC测定结果取自3次 蛋白样本分别从胚胎干细胞(ES)、拟胚体平行实验之一(EB)、贴壁后第8天(D 8)和第18天(D 18)的拟胚图5 酶活力测定体系中7一HFC代谢产物生体以及成年小鼠肝细胞(AL)中提取。每个样本取成随反应时间的变化80斗g上样量，10的SDS-PAGE电泳。Westem blotFig5 Timecourse vadationof7一HFC的蛋白条带用Quantity 0ne删422(Bio-Rad)分析结果取自3次平行实验之一metabolite concentIations intlle图3 UGTlal、UGTl

31、a6在胚胎干细胞分化enzyme aerometry systems为肝组织过程中蛋白表达变化Fig3 Protein UGTlal andUGTla6 in25胚胎干细胞分化肝组织过程mGsTl表达hepaticlike ceUs directedly diff宅ren变化在胚胎干细胞细胞分化为肝细胞终点tiated f而m mouse ES ceUswere (第18天)，可见mGSTl有较高表达，但表达丰detected bv Westem blot 度明显低于成年小鼠肝细胞(图6)，推测与测试样本夹杂非成熟肝细胞有关。26分化成熟肝细胞mGSTl的代谢活性取 分化第18天肝组织微粒体，

32、测定微粒体 mGSTl催化CDNB与GSH的结合反应活性。 空白对照不加微粒体。结果表明分化第18天 肝组织微粒体具有GsT催化活性，根据公式计 算其活性为765 nm01minmg，见图7。3讨论 图4分化成熟肝细胞匀浆UGTs的代谢活近年来，诱导多能干(induced pluripotent性HPLC色谱图stem)细胞问世及其深远的应用前景使同样具Fig4 HPLC analysis of 7一HFC glucu】mni 有多能性的胚胎干细胞研究再次受到高度关 dation in the derived mature hepatoc丫te 注。由探索胚胎干细胞获得的生命现象，可为 hom

33、ogenate f而m mouse ES ces afler 诱导多能干细胞的命运研究提供借鉴。应用胚 reacting with substrate of 7HFC and 胎干细胞定向分化肝组织体外体系，在药物代 UDPGA谢研究中有独到之处，可在药物研发早期获得万方数据浙江大学学报(医学版)第42卷一二二盈-ESI：13 1)8 1)18 Fl， A1kD细胞易感的初步代谢资料，以进一步在合适的蛐匿受受重。，动物模型进行研究。通过形成拟胚体的三胚层结构，在不添加诱导因子的情况下，胚层之间相互诱导产生肝 组织发育必需的信息和诱导因子，整个体系很 好地模拟了体内肝组织的发育过程，经过鉴定 分

34、化得到的肝细胞具有成熟肝细胞的基因表达 特征，白蛋白合成分泌和氨降解功能，并具备 P。卯酶的代谢功能，分化得到的肝细胞在白蛋白 分泌功能上优于原代培养肝细胞，实验流程相 对简单易行。在药物研究领域，该分化体系除了为药物 代谢研究提供体外模型，尚可用以筛选治疗肝脏疾病药物及相关机制研究。利用胚胎干细胞蛋白样本分别从胚胎干细胞(Es)、拟胚体(EB)、贴壁铺展培养后第8天(D8)和第18天衍生肝组织评价药物代谢具有其独特的优势，(D18)的拟胚体、胎鼠肝细胞(FL)及成年小鼠肝细它在分化培养体系中可存活并保持较长时间的胞(AL)中提取，第18天mGSTl有明显表达，接近肝细胞功能(约45 d)；而

35、原代肝细胞在培养于孕末期胎肝的表达量，但显著低于成年小鼠肝表 48h后，各项代谢功能均明显减弱，约传代2次 达量结果取自3次平行实验之一 后存活能力也明显降低；另由于永生化癌源性 图6 胚胎干细胞分化为肝细胞过程中 HepG2细胞株基因变异性(非整倍体)，其用于mGsTl蛋白表达变化药物代谢研究也缺乏良好的代表性。Fig6 Protein mGSTl hepaticlike cells UGTs和mGSTl是在体内最重要的相代 directedlv difkrentiated f南m mouse ES 谢酶系之一，主要分布在肝脏中。本研究前期 cells was detected bv Wes

36、tem blot 探索了肝组织分化过程中，相代谢酶1a1、1a6、1a9、眙2b5和m岱f1基因表达特征J，本研究进_二步明确了uGTlal、UGTl a6和mGSTl在分化过程蛋白表达变化及口催化活性特征。在分化过程中UGTl a1表达呈昌。 目9稳定上升趋势，而uGTla6和mGSTl则在分化型鬟成熟终点显著表达，且胚胎干细胞衍生肝组织督mGSTl表达量与胎肝类似，表明由胚胎干细胞分化的肝细胞在分化终点(第18天)相代谢酶功能趋于成熟。胚胎干细胞已有少量U肜1a1基因的表 催化活性测定体系中蛋白浓度为O64 mg1111；达J，随肝细胞不断分化，UGTlal蛋白表达也 空白为不加微粒体取自

37、3次平行实验结果之一 逐渐增加，至第18天表达量约为小鼠成熟肝的 图7胚胎干细胞分化第18天肝细胞 16。由于本研究未纯化肝细胞，分化系统中还 mGSTl酶催化活性的测定有其它细胞如心肌细胞、内皮细胞等存在，推测Fig7 The measurement of the activity of实际分化所得肝细胞UGTl a1表达量远高于成mGSTlinthe microsomeofthe 熟肝的16。derived hepatocytes f南m mouse ES在分化后期有UGTla6和mGSTl显著表cells on d 18 达，提示在胚胎干细胞向肝细胞分化过程中，万方数据第5期 李彤，等小

38、鼠胚胎干细胞衍生的肝组织微粒体相代谢酶表征537相代谢酶表达与催化功能逐渐趋于成熟肝细胞widespread protein supeI蕾姗ilyJAm J l【es曲 所具有的特征。因此胚胎干细胞分化至第18crit Care Med，2000，161(2P12)：s20一s24 天的肝组织，可用于多种经相代谢酶催化代6JACOBSSON P J，MORGENSTERN R。MANCINIJet a1Common stmctural features of MAPEG谢药物的体外评价。a widespread superf锄ily of membrane assoeiatedproteins

39、 w汕 higIllydivergentfunctionsin eicosafloid and 91utathione metabolismJPro玉eiH1OGAWA S，TAGAWA Y，KAMIYOSHI A，et a1Sd，1999，8：689-692 Crucial roles of mesode珊al ceU lineages in a7GU0 Mei”aIl，ZHU DaIIyan，DU Yue，et al(郭美murine embryonic stem ceUderived流沈阳liver媛，朱丹雁，杜 悦，等)Gene expfessions oforg柚ogenesis s

40、ystemJStem ce，2005，23phase enzymes in mouse embryonic stem cell-(7)：903913derived hepetocytesJJ zheji锄g uniV：Med2 1JJ7rSUTSUI M，0GAWA S，INADA Y，et a1Sd(浙江大学学报：医学版)，2007，36(3)：229Characterization of cytochrome P450 expression in235(in Chinese)murine embryonjc stem ceUderived hepatic tissue8ZHU Danyan

41、，DU Yue，HUANG Xin，et a1MAPEGsystemJDmg Metabo Disp惦。2006，34(4)：expression in murine embryonic stem cellderived696-701hepatictissue systemJSt哪CdlsDev，2008，173 1jBUCKLEY D BKLAASSEN C DTissue-aJ】d(4)：775-784genderspecificmRNAexPIssionofUDP9ZHU DY，WU J Y，U H，et a1PPARB facilitatingducuronosyltransferas

42、es (uGTs) in mice Jmatura上ion of hepaticlike tissue derived f而m mouseDmg Metab0 Disp惦，2007，35(1)：121一127embryonicstem cellsaccompanied by4BRESELL A，WEINANDER R，LUNDQVIST G，etmitochondriogenesisaIldmembranepotentiala1Bioinfo珊atic and em珥matic ch啪cterization ofretentionJJ Ceu Bi眦hem，2010，109(3)：498the

43、 MAPEG superfamilyJFEBS J。2005，272508(7)：1688170311【，l1 5 1JJJACOBSSON P J，MORGENSTERN R，MANCINI责任编辑黄晓花沈敏J，et a1Membraneassociated proteins in eicosanoidand glutathionemetab01ism (MAPEG) A，lll，ll，ll，lll，l，(上接第491页) priming sigIlals deriVed from macmphages infected7PHANG J M，DONALD S P，PANDHARE J，et a1with mycobacteriaJGna。2013，6l(3)：44l-The metabolism of pmline， a stress substmte，452modulates carcinogenic pathways JAmino