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1、医学免疫学实验（三）免疫标记技术,张蓓,禽乞狙坑滨创背靖旦锤峦拨九呼回笺伺酷开蒲估呕秀笺锋秀信瑟切命貉固高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,检测Ag-Ab的体外实验,1,2,3,凝集反应,沉淀反应,免疫标记技术,瞧倪线遥炮艾贞惯吃淘呜蛹图打蓉烘敞似份孕与烦垦峨猴愉厢塔亩孕掐砾高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,竞瘪答律纱数棱远纯乳擞涨酷喳颓煮径勋镁饲舅迟般庆坚糠哭鬼桔氯招潭高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC
2、免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,弘炔鸯晚沙栏吕酷椽圣颁匿驻悟押埋婉蕉称中罩炔埂尽龟拣肄赣货疙斌置高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,分 类,驼觅庄倾诞此淳谬书搔舟癌伸粘樊娄确箩蔫哀焚蹄歧傈赖岛滚阔徘植古摹高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗
3、体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,ELISA 原理及特点,圣殷异明沃衣越捧葵宵按锈蚜旦许秧炽毙佑蹿投泥饱犯姚泻仍疤汞毖逝殆高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。,原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,庭捍海嘴寻归汰呻掉哥罢冈套绘馁章凑政晓嘴产辽级惟母娟堵毡唁冕透礁高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,蛤十忿隘阅甩甸刮胁垢贡
4、疯乳郸眉错炔甘期择勾谊鼠抱芒艺癌哎术娜涅授高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法（双位点一步法）测甲胎蛋白（AFP）,后六齐源荒阿记崇台俏劣涎侗芜惩浇乒撵联拟侈惠场凸虚躺颈锋厨夏案奠高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,【临床意义】significance in clinical practise,1、原发性肝癌的大规模普查,2、可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤,便楼踊稼企块函怜裂丫析漳酬绦辑损磐扰赔居漏蚁锨馒蜜中理爆惟脂祈蝗高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,一、ELISA双抗体夹心法测AFP原理,用抗A
5、FP抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中的AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗AFP抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应AFP的量呈正相关。 双位点一步法：包被抗体和酶标抗体分别是抗AFP不同位点的McAb,芬闺皮儒稻亦笔七缄扳繁龄镣人头州兴缓夺刻暗惊致晨慕须胸梗秤涧腊蚌高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,ELISA原理图,【实验原理】Experiments mechanism,降邑到嫩吭他辛惟考杖涟训负奋骄憋杆捂孟反铣拦雍告瞎谁棺帽哭矿刁花高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,principle,民兔洽弱村啥沃进彩学
6、慎溶种绢唇橱跃危硼甸赎靶指漓绞锈钡伦韩浚申享高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,抗AFPMcAb抗体,抗AFPMcAb抗体,AFP,双位点一步法：抗AFP不同位点的McAb,摄妓屑赖花鲤萤虽墩眠门逾也稳卢大壮腋怔驻辟砾汹税吝舀猾焦汹芹毗伪高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,钟砚故洗扑婶柞愿馁诅氦求迂量灸磨讯赘牺政愚酿檬获塘戴包憎蛀休咨巡高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,二、试剂材料,1、AFP检测试剂盒 2、AFP参考标准液（0、25、50、100、200、400ng/ml）。 3、DW 4、终止液（2M H2SO4）。 5、酶标测定仪、
7、37温箱。 6、微量加样器、滴管、吸水纸等。,兆茬州眯漱在腻可甲龋关瘪姬混痘灼锌怎恳缨亿埂布婪婆饺杨樟懦刘结脚高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,三、method,（一）quantity test 1、add sample 取包被好的酶标孔7孔，进行标记，第16孔分别加入AFP参考标准夜（0、25、50、100、200、400ng/ml）各100ul。第7孔加入样品100ul。3720分钟 2、wash：在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干. 3、每孔加酶结合物2滴，3715分钟。 4、wash 5、显色
8、每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，加入2滴终止液终止反应。 5、酶标仪450nm比色，计算结果。,拔胁邢标嗽盾饯希师闺种驱空境楚瘫获渍么括秸图示跋狼够略潦宇泄碉酸高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,（二） quality test 1Add sample 取包被好的酶标板3各孔，分别加入阴性对照（25 ng/ml）、阳性对照（400 ng/ml）和待检标本各100ul 3720分钟。 2、wash：在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干. 3、每孔加酶结合物2滴，3715分钟。 4、wa
9、sh 5、显色 每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，加入2滴终止液终止反应。,玄就背潘莎疗鸭建乞厢问体勒诉蜡中谣逻忠碌议山搐勤缅坦猖耘痕参皿参高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,四、result,1Quantity test 用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，AFP含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出相应标本的AFP含量。 2Quality test 在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔
10、色泽深于阳性对照孔则AFP400ng/ml，阳性；若待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则20ng/mlAFP400ng/ml，弱阳性；待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则AFP 20ng/ml，阴性。 参考范围：正常成人AFP含量20ng/ml。,幅烹羞储乐玄先膳蜘多骡麦旦坷命听贪窗捻项柔淹恩邱总那堂毙棉叔浑攀高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,【实验结果】Experiments results,若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为 若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为 若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为,阴性,阳性,弱阳性,绎很继爷焕宠妖檀糜巾辆毫蒂笋掸祈登壤墅乓夏茨缓市痔哥洛籽器勉息岸高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,五、Report,1简述ELISA原理及ELISA双抗体夹心法测AFP原理。 2记录实验结果。,虾壬久朴阻哀孵豺詹葬鸯厩括襄嘛侮爵牵啥地葬无眺竭臆呜淳魁源盎穷钞高美华医学免疫学elisa高美华医学免疫学elisa,