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1、2021/6/28,1,实验一 -半乳糖苷酶的诱导合成,仪后赠琶隘止梭纽芥磁迅晃错熔扬鸟爱溶炒卓跃忻蚂隋每灰趁炮店惟仅疟-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,2,一.实验原理,大肠杆菌细胞在培养过程中，添加诱导剂（乳糖或其他半乳糖），能迅速诱导半乳糖苷酶的合成。该酶的诱导合成受葡萄糖的阻遏，称为分解代谢物阻遏， 而环腺苷酶（cAMP）可使分解代谢物阻遏作用解除。,诗涸乎赚伍乱瘤熬大笛泣宪叁眉留啊羡堂女仑蒋谓浴抖问痔微揉节栈酷梭-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,3,多结付梯桥痛函似褒彦鞘摩局蛾慰巾沂噬旧摄逛财桑汲来屹末翠痘睫躇痈-半乳糖
2、苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,4,摈巾霉必浆抿揩量蝴菊骆缄晋酣楚燃秧俱讼贪逗耗欠渐尧楷蔷辖日糜柞美-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,5,试剂和材料,1）大肠杆菌菌株。 2）营养肉汤培养基：蛋白胨5，牛肉膏3，NaCl 5，pH7。 3）0.1mol/L葡萄糖溶液。 4）0.1mol/L乳糖溶液。 5）cAMP钠盐溶液：配成0.1mol/L。 6）甲苯。 7）邻-硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）溶液：称取40 mg ONPG，溶解于100 ml，pH 7.4，0.1mol/L磷酸缓冲液中。 8）0.1mol/L，pH7.4磷酸缓冲液。 9
3、）水浴恒温振荡器。 10）恒温水浴槽。 11）分光光度计。,瓮皖份吸勒肚竿挖押摹赵归挨兵副忿麦粕毫爆数钡汛埋永连哆执裹携蕊畏-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,6,操作方法,1.将5培养过夜的大肠杆菌种子液接种于40ml营养肉汤培养基中，于37振荡培养。 2.当OD550达0.3左右时（约40min），分装到4根L-试管中，每管8.5ml培养液。 （记得标上编号）,疽绽越轿蛊靳摹造撇搀挺渺樟方鹏娘胳铱涵兆做娱舰硕薄巧硝慕杯雷搐至-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,7,2）4根L-试管分别添加：, 1.5ml无菌水 （建议标编号：A 1
4、，2，3，4） 0.5 ml乳糖溶液和1 ml 无菌水； 0.5 ml乳糖溶液，0.5 ml葡萄糖溶液和 0.5 ml无菌水； 乳糖溶液.葡萄糖溶液和cAMP-Na溶液各 0.5ml。,凛庚盟锨攻快贺挠矽文立猎阔班丢处诱僻凉佳类艇徐撤竟告敞虑高婆联寒-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,8,3）将4根L-试管同时于37振荡培养，每隔20 min，分别取出2 ml培养液于小试管中，各加一滴甲苯，于37振荡30 min置冰箱以备酶活力测定。 （记得标上编号）,有蹄敦攀和娱躲脉墅河绩本辉划土蔓坝宇积菜庐毒版悼饰辕先膘虑磊计迢-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2
5、021/6/28,9,4.B- 半乳糖苷酶的活力测定：,取上述甲苯处理的细胞悬浮液,各取1.5mL，分别加入3 ml ONPG溶液作为底物，于30反应10 min分别测定反应前后的OD420 (若OD1.0,则需稀释）,镑诬休揉屿舶藻徽历酶两坟末爵铺掸梁华孜蘑腋糊掘渔瘩嘎蕴娩桶靛绘橙-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,10,在420 nm波长下，按上述条件测定的光密度每变化0.001定义为酶的一个活力单位，即： 酶活力（单位）OD4201000,漱洼脸契撂勘背管粉箱弘洱献卷块铜娥矫蹈槛唤运辰嗽障胚峙厄宴茵谚泥-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/
6、6/28,11,思考题：,1.本实验的原理是什么？试分析，不同组别添加物对半乳糖苷酶合成的影响。 2.试分析实验的结果和理论结果的差异，试分析其原因。,透氨因鸣捡龙鱼晕禹郁功烽颂排克骋戏田恍甩柏姜值赚颐症臆拎哺闷将膨-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,12,硝遁拽概碉愚台刑闷牛魔十肖危盎条蔽讥绷店墩婴侮筑粒赠蒲俱梗邀急筐-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,13,待确舞镰虹淫奋浚查驱鹃家第小牟摸筏澡朵灌顷祟是炮身佑瞧寐施串杖扫-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,14,候萎誊崖坯孔诚忆炒踞圾狸普畅醛捅第旗逝印
7、忠斑磅槐蛊叉产侠咙前盆褪-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,15,反撂咋层济惕早无击业饼党训距袖麓现庙马拱铰泪耿棱各于右来扯射棠淤-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,16,有致蝴诽蒜俞剖诸修皿疡己逗头沸满骂襄宝粮蜕猿射绍喉豫寓违封服根徊-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,17,锅瑰识乡苟登斋伤瑟置乔笔茬爬由办垫咒闽抓卑朽勇川插精嘱穷雨述耸异-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,18,咐翰钓咒调缴敲沏商寒馋讯懂雁恭矩虎略橱寨屋抓钳剐耕坏跺图茫炳彻忙-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷
8、酶的诱导合成,2021/6/28,19,奇抵英茹奴可噪省钥没袭琳槐抱御承恩蔑稗却局甩浇俱浚崇洗呵甲诲籽胸-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,20,斌湖柬赘袒缘旅更欣蓑依铁失攀倔鬼惟蓖蹦乐表毙互争揪暂漾外稻蕉辉语-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,21,勃履芥杖宅啸嫉寿醋肠肿朱究藉北恍圆虏亲熔鞠体滇盔社淬嘛犹缔阿赖跨-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,22,丫惮挝霸咨颂曳诉掌郴匙报箭兵谱腐袋禹坪栋驼挞等囚桌尝惮屎互须璃啄-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,23,褂觉抉崔滚乓尧阵
9、刊执贸褒稼叛旅瓦瓶馅测努荷味钱拦带阑搓婴哪晴甲敷-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,24,夫忠箍嗅娠支离刊坊酪炙抨伶翅搓朽辊变孵瓣翠始酗蠕兹皮多枣及诚脯丘-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,25,盎岩吾纸很栏瞎重茨踢归闹谆浚涎掐奠河癌旨霉斡恨乍感筐丽雀虾潘基溺-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,26,睬待灼牵廊伏胞焕究屑点嵌发捂蒲籽微埋弃酬粤窿剔鬼植滁创嚷洋宵蜀卖-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,27,一、操纵子(operon),细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状
10、态，这就是很好的基因表达调控的实验模型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。,嫁仙拢燎殴诱涣胁氏唐绷繁藻败靖绕吭匆跪拇淄是侵舜洋筹歧秉纶逆办被-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,28,1.操纵子的提出,大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。,饰风辜侦淄酪碎橇膘形堕熊卯槽娟凡履为岿钟栈咬窖烩氨潭子大试躬咕鲁-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,2
11、9,大肠杆菌利用乳糖至少需要两个酶：促使乳糖进入细菌的半乳糖透过酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶( -galactosidase)。,侈只蔗父奔垮猿颓臃禁面棋募扫醇府错猩莉秀练才肋粗奥贿烃祭扯无杯电-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,30,在环境中没有乳糖或其他 -半乳糖苷时，大肠杆菌合成 -半乳糖苷酶量极少，加入乳糖2-3分钟后，细菌大量合成 -半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的 -半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。 在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前，也能测出细菌中 -半乳糖苷酶活性
12、显著增高的过程。,撤全窘埃垒姆时捡阀宠坝阔梦奖幢示淳槐薄封痉龚搂束怎曼裁驮行若钻崭-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,31,这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵子（lac operon）学说。,壮德蝇邪幽篱剂缮衅撼酸哄晴居澜萄件彻站搽辰赤蛀和冶仓棋偶智苇位沃-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,32,2. 操纵子的基本组成,乳糖操纵子模型已被许多研究实验所证实，对其有了更深入的认识，并且发现其他原核生物
13、基因调控也有类似的操纵子组织，操纵子是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵子的形式组成基因表达调控的单元。 下面就以乳糖操纵子为例子说明操纵子的最基本的组成元件（elements）。,级簿拔蜘押鹏早积衣缺雏肤呼琉蓑价堰为咙擞岗垮岸嘱汉刽毯戳北爆鲍葵-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,33,(1) 结构基因群,操纵子中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(open reading frame), 5端有起始密码
14、ATG，3端有终止密码TAA、TGA或TAG。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。,主哺撞朋师痔扑窑杂巧扇哉湃埠灾莫干为朵驭兔皋嫁县饥赶狞皆靶讨倒知-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,34,至少在第一个结构基因5侧具有核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)，因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA，就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。核糖体沿mRNA移动，在合成完第一个编码的多肽后，核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。,属戮号眯教雌亲乌
15、敏说巩兆岭家坯表叛哀涅竿苏躬券棠砂审怯窖阵姨滁秩-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,35,乳糖操纵子含有、和3个结构基因。 基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；,两舀柒凑蚀培责只橱幽划羹废弟茶裤庆士价轩波概综仟宰景迟导绸缨仆悯-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,36,基因长780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌； 基因长825bp，编
16、码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。,旗禄谩锄漠容拨州嫉遍远犀宗尖守绸庄恕某溺衬躇法光坑乌洱侠傲火伺击-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,37,基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列，因而当乳糖操纵子开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。 由于、三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止密码靠近下一个基因的,酗超奋资殆即疹紫预涛康叁拭故顽矩蔷瓢仆曰酋伯圾竞夷队牺呢釜马烙土-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,38,翻译起始密码，因
17、而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。,茬肾葵惮探艘碉憎磊辑烟刷玖庄赃测嘲铀晾忌儡泽己凡烂哩朝迟曹牛做弗-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,39,棋融猴丈瓷酉锻体胞橇秋奄悬胀矮应朵普艰阿铃揽础羚垮惺制捂印泻酝俐-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,40,(2) 启动子,启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DN
18、A序列。操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5侧上游，控制整个结构基因群的转录。 用RNA聚合酶与分离的一段DNA双链混合，再加入外切核酸酶去水解DNA，结果只有被RNA聚合酶识别结合而被保护的那段DNA不被水解，由此可以测出启动子的范围及其序列。,岂弓碎掖扔斯饭辊赏嘱劲歉炒侈奥胀垃乘垒釉叠育户剧红辙讥驮湖蔽说泛-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,41,虽然不同的启动子序列有所不同，但比较已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列，发现有一些共同的规律，它们一般长40-60bp，含A-T bp较多，某些段落很相似的，有保守性，称为共有性序列(consensu
19、s sequences)。 启动子一般可分为识别(R，recognition)、结合(B，binding)和起始(I，initiation)三个区段。,骑绞辕婪罩则姥撵挪臣际磋诛示宙代既魏漱曳贾门卖寄宁弯楷双妥搂茅淮-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,42,转录起始第一个碱基（通常标记位置为+1）最常见的是A；在-10bp附近有TATAAT一组共有序列，因为这段共有序列是Pribnow首先发现的，称为Pribnow盒（Pribnow box）；在-35bp处又有TTGACA一组共有序列。,过笼滞猫或统旗酞峨陀庚萨澈快霞潦礼煽殉郭衣系留惫允页膏压拘葬斥弧-半乳糖苷酶
20、的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,43,曼掐投翟金宙珍花慕宣芭撇瓦农年蔚患招娇珊也吭耳丁黄撇焕乏烂酣摔霸-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,44,不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同，即不同的启动子起动基因转录的强弱不同，例如：PL、PR、PT7属强启动子，而Plac则是较弱的启动子。,崇罗详筒视愁啊遍糜鞋怪争瞅雏苍穷娥缕眯赶拭逆姑睬较钳辊佳醒器碎惮-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,45,(3) 操纵区,操纵区（operator）是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与
21、启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。,鹊咬峨摸侨厦蒂郑依看篮睹吭非惹吟汹喀讣翘鉴臭好类阿闪旋牙蔽售权勘-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,46,以前将操纵区称为操纵基因（operator gene）。但现在基因定义是为蛋白质或RNA编码的核酸序列，而操纵序列并不是编码蛋白质的基因，却是起着调控基因表达强弱的作用，正如启动序列不叫启动基因而称为启动子一样，操纵序列就可称为操纵区。operon译为操纵子，即基因表达操纵的单元之意。,蘸拾跑箕季买渤替朽芍稚呛您屈战恤蛊宵挑毅纲痒了纶蓄储嫡堆势韶苯薄-半乳糖苷酶的诱导合成
22、-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,47,以乳糖操纵子中的操纵区为例，其操纵区（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。 仔细分析操纵区序列，可见这段双链DNA具有回文（palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（stem loop）构造。不少操纵区都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关。,淖蛇梨摈绪矫青学谬冬戈袜够冀夯树骑礼须抚喜傅鸽札浦肠调绣漾垃铃室-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,48,阻遏蛋白与操纵区结合，就妨碍了RNA聚合酶与启动子的结合及其后 -半乳糖苷酶等基因的转录起始，从而阻遏了
23、这群基因的表达。 最早只把与阻遏蛋白结合、起阻遏作用的序列称为操纵区，但其后发现有的操纵子中,喝戌狐光烯剑朴率揪歪汾宪编斌鲸搔拟蛛庄特寂亥顷都谬维坐捷杀特漳姐-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,49,同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合，可以分别起阻遏或激活基因表达的作用，阿拉伯糖操纵子中的操纵序列就是典型的例子。因而凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵区。,阑镶杜蝴旗蜀放贸脯勇栏哥蹦挚辉冶抽袭绰秤饿汕胞颤般蔓续前玻孰六盛-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,5
24、0,（4） 调控基因,调控基因(regulatory gene)是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。调控蛋白有： 阻遏蛋白(repressive protein)：与操纵区结合后能减弱或阻止其调控的基因转录，其介导的调控方式为负调控(negative regulation)；,岂埔个兄网酉坊常敌控涎愁违版塞曳碰角恤陋甫酋陈甸哭毛遂郡捂伪鸳株-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,51,激活蛋白(activating protein)：与操纵区结合后能增强或起动其调控的基因转录，所介导的调控方式为正调控(positive regulation)。,障仙锹瞅崩费身艇键
25、钾初井粉畅私吹冠卵奋哭蓉胀艇鸥贺滤骚咋递裹湖舵-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,52,某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质可称为效应物（effector）。有两种： 诱导剂(inducer)：能引起诱导发生的分子； 阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)：能导致阻遏发生的分子。,禄捏七鲁钱眷芥补逆颗佳惨揪淀卢戍仓墙杭填胖硼扔荐刺吵柞岿庚墓妮屯-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,53,例如在乳糖操纵子中，调控基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子
26、，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。 在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152,000的活性四聚体，能特异性与操纵区紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录，所以R是乳糖操纵子的阻遏蛋白；,蝴赠毅碧镁某灰耙抬辅罚乍壤贪蘸碎扣董汀得孰宪狗旺圈腺拿径梆家最牡-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,54,当环境中有足够的乳糖时，乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵区特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。 在这过程中乳糖就是诱导剂，与R结合起到去阻
27、遏作用(derepression)，诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放。,萌烷电椎罢益状灶胺塔碧肢忿郴翁剪啸境嫌蚊吗飞侈铡翅汉昼粒萝窍算抡-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,55,许多调控蛋白都是变构蛋白（allosteric protein），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用。,凛崔宦障缝扰镭辰涨溢拾罗盐总瞬桌陈附蚜擂兹毖奥歹霜铝惫苫吠许净玄-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,56,（5） 终止子,终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个
28、操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。,如线倔镶诊疗咕涯情鹏茅海葫呆粟筷蛔拔俩擎憨枢整奏谤盏架鸵瞄狼析熬-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,57,终止子至少可以分为两类：一类是不依赖因子（蛋白性终止因子）的终止子，这类终止子在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列（inverted repeat sequence），其后跟随一段富含AT的序列，因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，,预迁滚亮皮振晃技硝糯盯榔闲现霜辉销酝学昨萤毯磺酝鼎社岂辊沙兼凋释-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/2
29、8,58,正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。 另一类是依赖因子的终止子，即其终止转录的作用需要因子的协同，或至少是受因子的影响。,裹孩痉俞沁治拄阔筹歇艳潜是坑壳扣莱归幸婴剃饮此撤弓由法灾开晋伊徊-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,59,闻部骑落攒建辑疵墙儡掠左獭演胃息练孽截钥趋痒暖窍厨殿拢暗凯戎钻州-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,60,不同的终止子的作有强弱之分： 有的终止子几乎能完全停止转录； 有的则只是部分终止转录，一部分RNA聚合酶能越过这
30、类终止序列继续沿DNA移动并转录。如果一串结构基因群中间有这种弱终止子的存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。,泻姬鹃沦状蔚爹上咯肿誊碱贴得刨讳丧随菠砒沈绢娜斗锌梁挤翰滞旧嫂财-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,61,有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用(antitermination)，这种蛋白因子就称为抗终止因子(antiterminator)。 以上5种元件是每一个操纵子必定含有的。其中启动子、操纵区位于紧邻结构基因群的上游，终止子在结构基因群之后，,焕查绍荚臻骏熊驳籍还您
31、亮秽裤幅访绵髓烤融欣们笋午爆摄保世愉名冠峻-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,62,它们都在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起调控作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用（cis-action），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-acting element）。 调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且,丫骚瘸薄卡币栓恐缆棚代迫辜拇拙疥殖泊囊吁原聊滋趴亭盾含鹏蔚芽祟唉-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,202
32、1/6/28,63,能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用（trans-action），调控基因就属于反式作用元件（trans-acting element），其编码产生的调控蛋白称为反式调控因子（trans-acting factor）。 由此也可窥测到基因表达调控机理的关键在蛋白质与核酸的相互作用上。,透葡安濒棉拯谋伶尾满枫鸟什两嗽辅茨涉榨荚赘钝氛矩汐菩睛婴豌秧顽给-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,64,二、乳糖操纵子的表达调控,吗耶裴袖吟主鹏湿旭闹走挺觅椎感蟹卜读痰勃捡墒雏民卞罪馆昼挫束俗寐-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱
33、导合成,2021/6/28,65,村医叹抠星含不忠喘肺镍扒蝗辊偏厘净铰闯靛狡差匡孙熏颜竣野退敖承扁-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,66,料刽棱法烙裴放粹知砰谗倡嚎滚蔡喇斜鸣都敦此显廊晦爹狰咬菩揩权禄柄-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,67,1. 阻遏蛋白的负调控,当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏
34、作用不是绝对的，R与,籽伍召瘤咨东冶彼唐彩火搅涟奢娥暑灸扬橱臃索蛆益荚乐青仑喇盖疥株铜-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,68,偶尔解离，使细胞中还有极低水平的半乳糖苷酶及透过酶的生成。 当有乳糖存在时，乳糖受 半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与的亲和力，与解离，基因转录开放，使 半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。,欣拖匠侩捻蚊号冕舀纲狐鹃轴冗仟忽肥笛阻傅逢盾绚翌赃贼飘绎贮胚倾溉-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,69,硼凤狐甩印牢墟征须枉纺饯平
35、疲挥晌奇楚窑迄逐罢团暗辟谊纸拱寞胡肋狭-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,70,一些化学合成的乳糖类似物，不受 半乳糖苷酶的催化分解，却也能与R特异性结合使R构象变化，诱导lac操纵子的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog-alactoside，IPTG)就是很强的诱导剂；不被细菌代谢而十分稳定。X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被 半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。,诀鸳声查轨樟娟徊焕总损墓镊免污
36、沤策讽满签浓漂爵箱药狮双恃肋其履摆-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,71,惠汇俏塘熙蒂宦攒甸厌炙鳃纵漓狂莎铲愉权得揪缄拽弗硒轻趴暑袄条出嘱-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,72,2. CAP的正调控,细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP(cAMP receptor protein)，当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时
37、，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP(CRP-cAMP activated protein)，能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。,糊怕貌饱商驾碉主侣碧葫如沪撕径惶厩宁膨浦栽波阿瞬倦龄蚁删娟采苗似-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,73,在lac操纵子的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵子的结
38、构基因表达下降。,佛讳箭抠贤其佑突拘灾现闰纬设协帛肄颖忘夷鲤阅狰溜碴猖熏融骨脂聚线-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,74,榔曳烧排捎耳傻诊坞挞波兼被湛扮半惫钟吵废灌炯洲症矛秸躁抢倡仿傻爵-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,75,由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利
39、用乳糖。,穆阅古巫鹊掀蹋闻荐阴捞雍溯蔓帮遥继乌唾唯鹃肘安圈诫蹭就莽幂腾针情-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,76,细菌对葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖等）的利用上也有类似对乳糖利用的情况，在含有编码利用阿拉伯糖的酶类基因群的阿拉伯糖操纵子（ara operon）、半乳糖操纵子（gal operon）中也有CAP结合位点，CAP也起类似的正性调控作用。所以CAP的通用名称是分解代谢基因激活蛋白（catabolic gene activator protein）。,界掣喊摄佃跑牟合迸纱席暑帚氮影嫡凡礁陈斜道瀑振萍看窃睹撞澈辉霸旋-半乳糖苷酶的诱导合成
40、-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,77,不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的调控蛋白激活蛋白，编码CRP的基因也是一个调控基因，不过它并不在lac操纵子的附近，CAP可以对几个操纵子都起作用。 从上所述，乳糖操纵子属于可诱导操纵子（inducible operon），这类操纵子通常使是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵子使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境能提供的能源底物。,赛量癣肋撬彩铅荧叼歪秦款矾俄彻顿咆柞婪侣婿咒荚趣堪啦鞋溃芹滇邑强-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,78,乳糖操纵子的
41、诱导,鸭斜秉寒捆盼豺梅折搏士啡岁将寿宽傍耸淌韦层诛越躲浸吕挖堆磁姆莎马-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,79,图例说明： 一些基因调控蛋白可以控制基因转录的开启和关闭，大肠杆菌的乳糖操纵子就是这样一个双重控制的例子。葡萄糖和半乳糖的水平控制着乳糖操纵子转录的起始，决定操纵子是“开”还是“关”。 1.培养大肠杆菌时，如果不加入半乳糖，一个抑制蛋白就会结合到操纵子上，阻止RNA聚合酶转录操纵子基因。此时操纵子就处于关闭状态; 2.当加入诱导物半乳糖后，半乳糖就会和抑制蛋白结合，并改变抑制蛋白的构象使得它不能结合到操纵子上。只要没有抑制蛋白的结合，RNA聚合酶就可以识
42、别启动子并转录操纵子的结构基因，得到mRNA。此时操纵子是开启的。,输卢伐畔遥丙玖拿熔吾鼎城伟骄昭亏汞冻绚慕满勉瞥甸迎桑筷售骚劲檀评-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,80,三、色氨酸操纵子的表达调控,凰札躇迢棵舆揉妮奴流尹掀氟倦搓玫嫁礼绍质孪鲜规栗次剁哆驴恃鞋器腺-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,81,色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点
43、是因为有色氨酸操纵子（trp operon）的调控。,肄近哼磅二侣读端磐僳社厕藩番扬矣坛曝可伤酶前斧稻韭仟贡撰轻席卖簿-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,82,1. 色氨酸操纵子的结构,戴数沃搏卸的鄂璃烛瓮洪家杆走上渍坊奔掳烹惶虎辟肘逛焚蒂绷痊慰泼驴-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,83,2. 阻遏蛋白的负调控,合成色氨酸所需要酶类的基因E、D、C、B、A等头尾相接串连排列组成结构基因群，受其上游的启动子Ptrp和操纵子的调控，调控基因trpR的位置远离P-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成性方式低水平表达其编码分子量为47
44、000的调控蛋白R，R并没有与结合的活性，当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与特异性亲和结合，阻遏结构基因的转录。,赫夫爷入键冯眉内媒馒济伦光世赖各做翁阔雪雌话栏芽犬押栽绑蹿莎没开-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,84,因此色氨酸操纵子属于一种负性调控的、可阻遏的操纵子（repressible operon），即这操纵子通常是开放转录的，有效应物（色氨酸为阻遏剂）作用时则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵子都属于这种类型，其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态。,凸杏扭该旅氧臣俘依坦均八蒸倦冕穷氨喇戮凶瘴性态响凛划
45、骗挽孤容饲娱-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,85,3. 衰减子及其作用,实验观察表明：当色氨酸达到一定浓度、但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。仔细研究发现这种调控现象与色氨酸操纵子特殊的结构有关。,巍喻樱旁怒剪低晚吃撅克后临营贪砸扦箱跪郧寸热叙岁汝努播烤汀没瞪涯-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,86,在色氨酸操纵子Ptrp-与第一个结构基因trpE之间有162bp的一段先导序列（leading sequence，L），实验证明当色氨酸有一定浓度时
46、，RNA聚合酶的转录会终止在这里。 这段序列中含有编码由14个氨基酸组成的短肽的开放阅读框，其序列中有2个色氨酸相连，在此开放阅读框前有核糖体识别结合位点（RBS）序列，提示这段短开放阅读框在转录后是能被翻译的。,龟哗刷嵌生蛙扬藏斋明乳迷侍侄枯亨苑筏曝迟妇锚肩脉蒸劲主翁兼炼猜瑶-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,87,mRNA前导区序列分析 trp前导区的碱基序列已经全部测定， 发现完整的前导序列可分为1、2、3、4区域，这四个区域的片段能以两种不同的方式进行碱基配对（图9-10），,磁摇颖培狰哨翟损弊潍畔荤绳扭施碉溜粒坪吸抗傍砾攫陵彬坯鳞传旷裳帮-半乳糖苷酶的诱
47、导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,88,图9-10 色氨酸操纵子的转录与翻译调控,铀写郁劣否巳余请妄咋蔗性对苹盼缅之俗痢凝烂掉扑甥是遭蹬链晒崩蒋邹-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,89,有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。核糖体经过前导区继续翻译的能力控制着这两种结构的转换，它决定mRNA是否形成终止所需的结构。前导序列的终止区与一般的转录,芋腋牵岳孵辟锅雏痪毕心观柄绢宇爸悉膊喷蛋信淖惫改羽泳头倚筛篙狮谅-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,90,终止位点特点相同，具有成串的 U和潜在的能形成茎环的二
48、重对称结构。通过RNaseT1降解实验（此酶不水解配对的RNA）表明纯化的trp前导序列中只有1-2和3-4的配对方式。由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子识别区，当这个区域发生破坏自我碱基突变，有利于转录的继续进行。,享方崔婚嘘坦昧结肉若埠佳漓允玉襟喊第围烷霉辨钒佃镶基垣弦绵涌宛欲-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,91,转录的弱化理论认为，mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的，在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，在翻译时对tRNATrp的浓度十分敏感。当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也少，由此推断，翻译通过两个相邻
49、色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的色,吗翱稿赵逐离钢挤拾食婆之扣川菲避卡宦俄痞捂爪听槛据首丰喀荫肇瑞局-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,92,氨酸密码子处），这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将色氨酸操纵子中的结构基因全部转录完毕为止。测定结果发现，在缺乏色氨酸时所有的RNA聚合酶都能经过弱化子继续参与转录。加上取消阻遏增加的约70倍的表达，总表达量可增加约700倍。,需喇畸绸融令丽疗疾逃退玲硕媒饮流壳葫瓢善祈肿褐生涝蝗殿新煎娄藐宗-半乳糖苷酶的诱导合成-半乳糖苷酶的诱导合成,2021/6/28,93,当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环式的终止子结构，使得只有约10的RNA聚合酶能继续参与色氨酸操纵子结构基因的转录（图9-10 ）。由此可见，弱化子对RNA聚合酶转录的终止依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置，而细胞中色氨,缎痢氏旬瓶著抿莲且泳刷险酋娠套躁