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1、疏水作用层析,Hydrophobic Interaction ChromatographyHIC,疏水层析的概念 疏水层析的原理 疏水层析过程 影响疏水层析的因素 疏水层析的应用 疏水层析的发展趋势,内 容 简 介,疏水层析的概念,疏水层析亦称疏水作用层析从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类。 疏水层析（HIC）是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合（盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱），而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质初步的分离，
2、用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。,疏水层析原理：,特点：利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱盐。 利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。 *洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出； 盐浓度低，疏水强的Pr后流出。,三、疏水层析过程,凝胶处理,装柱,加样,平衡,洗涤,洗脱,再回收,一、层析柱的制备 1层析柱规格 所使用层析柱之规格与普通层析的相似 2固定相 在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)-Sepharose C
3、l-4B吸附剂作固定相。 苯基-Sepharose Cl-4B适合于分离纯化与芳香族化合物具有亲和力的物质。 辛基-SepharoseCl-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的物质。,3装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间； 采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物； 并以50(mV)浓度悬浮于样品缓冲液中； 尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。,二、加样与洗脱 加样前，在样品溶液中要补加适量的盐类。 (如上所述，加1molL(NH2)2SO4或2molLNaCl，以使样品中的有效成分变性，并能与固定相很好地相互吸附
4、。) 把此样品溶液徐徐加入固定相(使有效成分与固定相之间作用0.5-1h)后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐浓度的平衡缓冲溶液洗脱， 与此同时，要用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液，并对收集的每部分溶液进行检测。 固定相进行再生处理后可重复使用。,疏水作用层析过程的参数,固定相类型：包括基质的类型、配基的种类和取代程度 流动相组成：盐的种类和浓度、流动相的pH、以及其他添加剂的影响 层析条件 ：温度、流速等,疏水层析的影响因素： 1、盐类和盐组成 盐的摩尔表面张力增大，蛋白质在疏水层析柱内的吸附能力相应增大。 各种盐离子和离子对具有破坏周围水分子有序排列的能力。 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水
5、层析介质上的吸附能力具有最为重大的影响。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。,2、离子强度 离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低离子强度来提高组分的解析附能力。 HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。 3、溶液的酸碱度 溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用；远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定相配基结合，但有利
6、于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。 4、柱温 一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。,排在最左边的离子，盐析作用（蛋白质溶解度低）最强，洗脱能力最弱；即疏水作用强 排在最右边的离子，洗脱能力最强，盐析作用最弱。,技术,介质的选择 样品的准备 层析条件的优化 层析介质的再生、清洗和贮存,介
7、质（基质+配基）,基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质； 近年来研制超大琼脂糖(superporous) ，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率； 壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用。,HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与反相层析介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。,R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度。,偶联至基质的常见配基类型 （A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基,对某些蛋白而
8、言，上述有些配基与其结合力太强，为洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。,介质的选择：,在HIC中，应选机械强度较大的刚性基质；若待分离物质分子量很大，且样品量较大，则应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待分离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质。 HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4C8之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生-相互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。,样品的准备：,往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓
9、度达到与流动相A（平衡液）中基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件 ，同时选择适当浓度及pH的缓冲液。 HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样,层析条件的优化：,优化目标： 目标分子达所需纯度的基础上，获得尽可能高的回收率，同时力求缩短分离所需时间、降低分离成本。 HIC中，层析条件包括流动相A，流动相B，洗脱方式，层析柱的柱长，流速，温度等,流动相A与流动相B,流动相A的缓冲液的种类、pH ，盐的种类和浓度的选择： 缓冲液种类据所需的pH选择，注意目标物的稳定性，浓度一般在0.01-0.05mol/L； 不同盐类对疏水作用的强度有影响
10、，层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随目标分子的疏水性而异，(NH4)2SO4常用0.752mol/L，NaCl为14mol/L； 流动相B为含盐量较低的缓冲液，缓冲液类型与流动相A一致。,洗脱的方式：,采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）； 通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质） 往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）,层析介质的再生、贮存 ：,再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适的清洗剂进行清洗
11、，NaOH溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的清洗剂。 贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物的生长。,应用,蛋白类（包括酶）、肽类的分离纯化（广泛） 重组蛋白的分离与复性 活性蛋白与非活性蛋白的区分,近年来，随着层析技术的发展，与HIC相关的其它层析技术也得到了发展，主要有以下两种： 1）亲硫性疏水层析(thiophilic chromatography) 2）疏水电荷诱导层析 (HCIC),五、发展趋势,亲硫性疏水层析,该技术主要在疏水作用的基础上增加了硫元素
12、的相互作用。利用层析介质与含硫蛋白质和非硫蛋白质的亲硫性差异，对蛋白质加以分离。具体应用条件和HIC类似。 通常这类介质通过硫醚键将配基和基质联接，如ButylS-Sepharose 6 Fast Flow，已用于乙肝病毒表面抗原的分离纯化。,疏水电荷诱导层析(HCIC),HCIC是近几年来发展起来的一类不同于HIC的新技术，由Burton等 1998年提出； HCIC与蛋白质的作用除了疏水作用，还有电荷间的相互作用； HCIC与蛋白质的结合是由疏水作用推动的，与HIC不同的是，这一过程通常是在不改变离子强度的条件下实现的； 洗脱时也不像HIC那样通过改变盐的浓度而是由pH值的改变来实现的。,
13、通常HCIC的配基中含有吡啶环，中性时不会带有电荷，而随着pH值的降低，吡啶环中的氮原子会带有正电荷，这样和带同样电荷的蛋白质发生排斥，从而实现解吸（机理如图）； 另外，为了能在低盐浓度甚至无盐时对蛋白质进行吸附，其配基密度比HIC要高； 同时为了增加其选择性，配基结构中还常常含有硫。,HCIC主要用于抗体的分离纯化 ，具有价格低、效率高、化学稳定性强(可用lmolL NaOH清洗)、适用范围广(可用于IgG，IgA，IgE，IgM和抗体片段的分离)的特点，目前，已有商品化的介质，如Ciphergen公司生产的MEPHyperCell； 由于HCIC比HIC、IEC拥有更温和的吸附和洗脱条件，
14、在蛋白质类的分离上应用前景广阔。,总结,离子交换层析之后是最后一步纯化，疏水作用层析(hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)。 蛋白质表面有一些疏水区域，如果在蛋白质样品溶液里面加足够的盐， 就会与这些疏水区域争夺水分子。没有了足够的分子，这些疏水区域倾向 于与其他疏水区域结合。 HIC的吸附剂上衍生有非极性基团，可以与蛋白 质的疏水区域结合，这样蛋白质就能绑到柱子上。要想把蛋白质洗脱 下来，则要用低盐缓冲液冲洗，盐浓度下降之后蛋白质与柱子的疏水相互 作用也被削弱，所以能被冲洗下来。由于HIC要求样品的起始盐浓度很高， 所以特别适于作为硫酸铵沉淀或者离子交换层析后续步骤。因为硫酸铵沉 淀（无论是上清还是沉淀）和离子交换层析的产物，盐浓度都非常高，如 果直接再跑HIC，不但省了透析脱盐的一步，还进一步纯化了蛋白。 现在 常用的HIC 树脂上的疏水基团有两种，一种是苯基另一种是辛基。比 较而言，辛基 group更加疏水一些。我们这一次的实验中用的是苯基 sepharose。值得强调的是，对于HIC而言，树脂的衍生基团并不是越疏 水就越好的。因为如果太疏水的话，与蛋白质的结合会十分紧密，以至于 要加入有机溶剂，才能冲洗下来。但是有机溶剂同时又有可能使蛋白变性。,谢谢！,