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1、Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello)一、 lentiCas9-Blast质粒的基本信息：http:/www.addgene.org/pooled-library/broadgpp-human-knockout-brunello/由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。换成另一种。1. lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。2. 试剂盒提取质粒，并测定浓度。二、 慢病毒包装质粒1 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整
2、细胞为7*105在5ml的DMEM培养基中。37 、 5% CO2 培养箱内培养。待细胞密度达70%80%时即可用于转染。2 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。3 向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为 2.5 ml，在室温下温育5分钟。4 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 l Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。6 混合后，在室温
3、下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。7 DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 , 5% CO2 细胞培养箱中培养。8 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 、 5% CO2 培养箱内继续培养48小时。10 收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。11 于4 ，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。12
4、以0.45 m滤器过滤上清液于15ml 离心管中。三、 慢病毒转染细胞参考网址：http:/www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines/1. 取六孔板铺50000个细胞，37C, 5% CO2 培养，待细胞长到70%，换含有8ug/mlpolybrene的培养基培养。2. 慢病毒悬液用含有10ug/ml的DMEM培养基稀释。3. 六孔板中每个空加一种浓度的病毒稀释液，每空0.5ml。4. 孵育4872小时。5. 换成含有适宜浓度的抗生素的培养基培养1.5ml，筛选出转染成功的细胞。抗生素浓度的摸索:用培养基稀释抗生素为1ug/m
5、l、2ug/ml、3 ug/ml、4 ug/ml、5 ug/ml、6 ug/ml、7 ug/ml、8 ug/ml、9 ug/ml、10 ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，35天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。6. 持续加药筛选直到细胞不再大量，并能稳定表达Cas9。一般筛选需要12个星期。7. 在转导sgRNA文库前27天改用正常培养基培养。（或者先测定MOI值后，根据MOI加病毒的量，操作可参照sgRNA的转导）四、 检测病毒转染的结果1. 试剂盒提取质粒2. PCR扩增（https:/media.addgene.org/cms/filer_public/61/16/61161
6、9f4-0926-4a07-b5c7-e286a8ecf7f5/broadgpp-sequencing-protocol.pdf）。引物：Forward Primer: dCas9-F2 CCAAAGAGGTGCTGGACGReverse Primer: Blast-R GCTCTTTCAATGAGGGTGGA3. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用试剂盒纯化PCR产物4. 通过免疫印迹扩增，收集，裂解并测试Cas9表达的细胞群。五、 lentiGuide-Puro骨架基本信息六、 SgRNA library的设计:在基因芯片上合成核苷酸，分离出来后，进行PCR扩增。七、 把设计好的sgRNA整合到
7、质粒上：https:/media.addgene.org/data/plasmids/52/52963/52963-attachment_IPB7ZL_hJcbm.pdfa) SgRNA文库的构建1， lentiGuide-Puro载体可以使用BsmBI和一对退火的寡核苷酸可以把sgRNA克隆到骨架中。 首先把5ug的lentiviralCRISPR 质粒用BsmBI混合37度，酶切30min。2， 试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）纯化酶切的质粒，并用EB或ddH2O溶解。3， sgRNA1和sgRNA2用T4链接酶连接。4，反应程序： 5， 把第三步的产物用无
8、菌水或EB以1：200的比例稀释。6， 质粒与sgRNA的连接整合，温室放置10min。7. 异丙醇沉淀核酸，75%乙醇洗涤后，晾干，用ddH2O溶解。8. 测质粒DNA的浓度。八、 sgRNA文库的扩增https:/media.addgene.org/cms/filer_public/56/71/5671c68a-1463-4ec8-9db5-761fae99265d/broadgpp-pdna-library-amplification.pdf质粒转化电感细胞试剂: 100 L electrocompetent cells (STBL4TM, Thermo Fisher Scientifi
9、c, 11635-018) 400 ng library plasmid DNA 4 electroporation cuvettes (0.1 cm gap, Bio-Rad, 165-2089) 10 mL SOC (1X SOC, New England BioLabs, B9020S) 4 bioassay plates (500 cm2, LB agar + antibiotic) 2 Maxi-preps (Qiagen HiSpeed Maxi, 12663) Biospreader (Bacti Cell Spreader, VWR International, 60828-6
10、84) Electroporator (MicroPulserTM, Bio-Rad, 16521001 37度预热SOC培养基15min和含有100ug/mlAMP的LB培养基。2 取电转化感受态细胞于冰上解冻，,标准质粒也置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。 3 取400ng的质粒加入100ul的电感细胞中，充分混匀。4 取25ul混合液把电击杯放在电击仪上进行电击（1.8kv）。 5 迅速在电击杯中加入1ml SOC培养液（无抗生素），然后充分混匀，移到15ml的离心管中.6 重复3次，增加SOC培养基到10ml。7 取两空离心管，分别加入5ml上述混合液。8 37度放置1h。9
11、取10ul的混合物做4个浓度梯度，每个稀释10倍。10 每个浓度（稀释103、104、105、106）取10ul涂布于含有100ug/mlAmp的LB培养基。11 倒置培养皿，37培养1618小时。12 计算电转的效率，菌落数*稀释倍数*电感细胞数。13 第二天刮取菌落接种含有50mlLB和100ug/ml Amp培养基的锥形瓶培养，摇床37度培养过夜。九、 检测扩增的质粒1. 用试剂盒提取质粒，按说明书操作。并测浓度。2. 双酶切质粒3. 用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析电泳后的条带的大小。十、 慢病毒包装质粒1 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调
12、整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿，37 、 5% CO2 培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%80%时即可用于转染2 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。3 向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为 2.5 ml，在室温下温育5分钟。4 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 l Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡
13、。必须在5分钟之内混合。6 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。7 DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 , 5% CO2 细胞培养箱中培养。8 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 、 5% CO2 培养箱内继续培养48小时。10 收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。11 于4 ，4000
14、g 离心10 min，除去细胞碎片。12 以0.45 m滤器过滤上清液于离心管中。或者：1 用ddH2O溶解50mg的PEI，调PH为7.1，定容到50ml。2 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为1.8*107在45ml的DMEM培养基中。37 、 5% CO2 培养箱内培养。3 取一个50ml离心管混合以下物质：45 加入195ul的PEI试剂，常温放置10min。6 再加入25mlDMEM。7 跟换新的培养基8 48h后收集上清，0.45 m滤器过滤上清液于离心管中。十一、 慢病毒文库转染模式细胞并进行基因筛选1.测定最适的MOI(1) .测定前一天，
15、取6孔板，每个孔加4106个细胞，和2ml含有8ug/ml dpolybrene的培养基。(2) 测定病毒的浓度，准备710个无菌的Ep管。在每个管中加入90 l的无血清培养基。 (3) 取待测定的病毒原液10 l加入到第一个管中，混匀后，取10 l加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。 (4) 六孔板的每孔吸取90 l培养基丢弃。加入90 l稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。 (5) 24小时后，换成完全培养基2ml。小心操作，不要吹起细胞。 (6)观察荧光感染后72小时后，于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况，确定细胞状态较好且荧光数较多的孔，对应为较适宜的MOI值。MOI=病毒量
16、/细胞量。（确定MOI范围a带荧光标签的慢病毒：观察荧光感染后72小时后，于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况，确定细胞状态较好且荧光数较多的孔，对应为较适宜的MOI值。b 不带荧光标签的慢病毒：通过抗性筛确定最适MOI值。慢病毒感染后72小时加入100ug/ml的AMP，培养3-5天，镜下观察，选取细胞存活率较高且细胞状态较好的孔，对应为较适宜的MOI值。）2. 取病毒（最适的MOI值）感染已经稳定表达cas9的细胞系，于37 、 5% CO2 培养箱内继续培养48小时,并同时转导未导入Cas9的细胞做对照。3. 48h以后向细胞添加合适的选择剂量的嘌呤霉素。嘌呤霉素浓度的摸索:用培养基稀释
17、嘌呤毒素为1ug/ml、2ug/ml、3 ug/ml、4 ug/ml、5 ug/ml、6 ug/ml、7 ug/ml、8 ug/ml、9 ug/ml、10 ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，35天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。4. 选择成功转导的细胞后，改成正常的完全培养基培养27天。（如果是crispr和cas9 分开额双质粒系统，前面导入的就是携带cas9的质粒，带cas9稳定表达后，在这里后就能把构建好的sgRNA文库转染细胞，重复以后的步骤，MOI与加cas9时的相似，然后用相应的抗生素在筛选细胞。）5. 提取筛选出来的细胞的基因组DNA和未转导sgRNA的细胞基因组DNA。 7. 基因组高通量测序和进行RIGER分析确定出几个高丰度的sgRNA，确定出目的基因。