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1、抗生素微生物检定法,1,抗生素微生物检定法,* *药品检验所,抗生素微生物检定法,2,抗生素检测技术专题研讨班概况,中国药典2010版抗生素检测技术与方法概述 中国药典2010版抗生素有关物质检测 残留溶剂测定法 抗生素聚合物检查 中国药典2010版抗生素溶出度方法介绍 抗生素微生物检定法 中国药典2010版抗生素质量标准建立概述 抗生素药品质量标准提高的价值与技术策略,抗生素微生物检定法,3,抗生素药品的特点,纯度一般较化学药品低 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发生变异 稳定性一般较化学药品差 结构较一般化学药品复杂,抗生素微生物检定法,4,抗生素检测技术与方法,高效液相色谱法 高效毛细
2、管电泳法 气相色谱法 高分子杂质测定法 抗生素微生物检定法 溶出度 不溶性微粒 澄清度 溶液颜色,抗生素微生物检定法,5,抗生素微生物检定法,定义：抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以微生物的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成分效力的方法。 方法：本法是在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的一直作用，计算抗生素活性（效价）的方法。,抗生素微生物检定法,6,量反应平行原理,琼脂球面扩散动力学公式： 奠定了管碟法量反应直线公式的基础,抗生素微生物检定法,7,抗生素微生物检定法的概况,微生物检定法的特点 1.微生物检定法可直观、特
3、异性地反映出抗生素药品的抗菌活性，显示临床的特点； 2.多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、寒冷和活性的关系； 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的分析方法测定其效价； 4.同时微生物法所需仪器设备简单，成本较低。,抗生素微生物检定法,8,微生物检定法的局限性,本法测定的是有抑菌作用物质的总效价，测定结果不能反映药品的纯度，不能排除其他组分或活性杂质的干扰。 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选择性差，效价测定受其他成分的影响。 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的剂量反应
4、曲线偏离，无法测准妥布霉素的含量。,抗生素微生物检定法,9,抗生素微生物检定法分类,1.稀释法 2.浊度法 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗生素的效价,抗生素微生物检定法,10,抗生素微生物检定方法比较,抗生素微生物检定法,11,抗生素微生物检定法包括管碟法和浊度法,管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效
5、价。,抗生素微生物检定法,12,抗生素微生物检定法包括管碟法和浊度法,比浊法：通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的发疯，可用于抗生素药物的含量（效价）测定。,抗生素微生物检定法,13,浊度法与管碟法方法比较,抗生素微生物检定法,14,浊度法,优点： 速度快，试验过程3-4小时，可在当天获得结果 易于操作，比浊仪在线培养和测定，具有客观、精密便于自动化操作的优点 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都较扩散法好,抗生素微生物检定法,15,浊度法,缺点：
6、对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，如培养温度要求一致，比色管的清洁等 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都会影响抗生素效价的测定,抗生素微生物检定法,16,管碟法,利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行原理并采用交叉实验设计方法。在相同的试验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）的大小来测定供试品效价的一种方法,抗生素微生物检定法,17,二剂量法,一剂量法,三剂量法,抗生素微生物检定法,18,一剂量法,标准曲线法 将标准品一组剂量的对数与微生物的反应再绘制成直线图，相同条件下，测的供试品对微生物的反应之，在标准品的标准曲线上查
7、出引起该反应的抗生素的相对浓度及效力。 一剂量法一般用于制备标准曲线或测定血药浓度,抗生素微生物检定法,19,二剂量法,2.2法：用标准品、供试品各两个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对供试品产生的效力。 二剂量法一般用于抗生素药品效价的常规测定。,抗生素微生物检定法,20,三剂量法,3.3法：用标准品、供试品各三个剂量，根据量反应平行线原理，在相同的试验条件下，比较标准品和供试品二者对供试品产生的效力。 三剂量法一般用于抗生素药品的仲裁或标准品的标定。,抗生素微生物检定法,21,管碟法,管碟法的操作步骤 预试验 试验准备 底层的制备 供试品、标准品溶液的制
8、备 菌层的制备 加钢圈 滴加抗生素溶液 培养 抑菌圈的测量 结果的可靠性检验及效价测定,抗生素微生物检定法,22,管碟法的操作步骤,预试验 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在1617.5cm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在1822cm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在1518cm。,抗生素微生物检定法,23,试验准备,抗生素微生物检定法,24,试验准备,抗生素微生物检定法,25,管碟法的操作步骤,培养基的制备,抗生素微生物检定法,26,管碟法的操作步骤,底层的制备： 每碟加
9、底层培养基20ml，待培养基凝固后，盖上陶瓦盖，置3537培养箱中，待用。 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的培养基5ml作为菌层,抗生素微生物检定法,27,管碟法的操作步骤,加钢圈 滴加抗生素溶液,抗生素微生物检定法,28,培养,温度：一般为3637 时间：一般为1618h,抗生素微生物检定法,29,结果计算及判断,抗生素微生物检定法,30,结果计算及判断,抑菌圈的测量以及结果的可靠性检验及效价测定,抗生素微生物检定法,31,多功能微生物自动测量分析仪,抗生素微生物检定法,32,结果可靠性分析,试品间（F1）：供试品的估计效价是否合适。P0.05 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。P0
10、.01 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率是否有显著差异。P0.05 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否显著。P0.01 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显著。 P0.05,抗生素微生物检定法,33,结果计算及判断,重试判定 抑菌圈大小的要求 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的可信限率除特殊规定外，不得大于5%。 实测效价与估计效价：应在90110%之间，否则结果仅作为初试，应予以重试。 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍复试。,抗生素微生物检定法,34,二剂量法计算,抗生素微生物检定法,35,结果计算及判断,抗生素微生物检定法,36,检定的影响因素
11、,标准品与供试品的同质性 抑菌圈质量的控制 直线斜率的控制 直线截距的控制,抗生素微生物检定法,37,抑菌圈的形状,试验中抑菌圈常有破裂、不远、甚至无圈的现象： 在滴加抗生素溶液时药液溅出、碰到钢管壁引起漏液，导致不圆 双碟、钢管等残留抗生素或清洁液 试验菌菌龄过老、检定菌被烫死等 缓冲盐的Ph值和盐浓度影响扩散,抗生素微生物检定法,38,抑菌圈的大小,当抗生素浓度不变时，体积的对数与抑菌圈的直径或面积呈直线关系，故钢管中滴加抗生素的体积应一致。所以钢管的大小（包括：重量、直径、高度）应该严格控制。 抑菌圈的大小受时间增减的影响，故预先延长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。 加液时间的差异的影响,抗生素微生物检定法,39,抑菌圈边缘的清晰度,扩散系数不一致 试验菌的生长周期不一致，对抗生素的敏感度不同， 培养基的材料、成分、质量、Ph值、盐浓度及培养时间 多组分抗生素中，各组份的抗菌活性不同，扩散系数不同、以及交叉作用的影响,抗生素微生物检定法,40,谢谢！,祝大家： 新年快乐！ 万事如意！ 身体健康！,