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1、万古霉素发酵液凝聚与絮凝研究【摘要】对凝聚与絮凝法预处理万古霉素发酵液的工艺进行了研究，初步选用三种凝聚剂、三种絮凝剂，以滤速、沉淀物重量、滤液澄清度、滤液中万古霉素含量以及万古霉素液相色谱峰面积占总积分面积百分比为指标，考察凝聚剂与絮凝剂的作用效果。从中选择偏铝酸钠、壳聚糖，并详细研究其用量、pH对预处理效果的影响，结果显示偏铝酸钠为较合适的凝聚剂。进一步讨论了搅拌时间对凝聚效果瞄的影响，通过正交试验确定了最佳凝聚工龛艺条件为：pH4，偏铝酸钠用量750晗mg/L，搅拌时间6min。【关键狨词】万古霉素偏铝酸钠壳聚糖凝聚絮凝牺Studyoncoagulatio钚nandflocculatio
2、nof碱vancomycinfermenta息tionbrothABSTRACTCoagulationandflo粮cculationprocessof眼vancomycinfermenta碥tionbrothwerestudi顾ed.Threecoagulants陈andthreeflocculant崂swerechosentoexami踱nethEireffectsonth黹epretreatmentproce鸿ss.Thefactorsinclu裾dingfiltrationrate裸,precipitationwEIg“ht,filtrateclarifyinglevelandvanc
3、omy蹲cinconcentrationinthefiltratewerecon卵sidered.Sodiummeta畋aluminateandchito歆sanwereselected.Th霁eeffectsonthepretreatmentbycoagulant/flocculantconcent畅rationandpHvaluewe扑restudiedindetail.宇Sodiummetaalumina祓tewasconsideredtobeasuitablecoagulan絷t.Furtherexperimentswerecarriedouttostudyhowthestirrin缕
4、gtimeeffectedtheco矛agulation.Theoptim悱alcoagulationproce宀ssconditionwasobtainedbyorthogonalde让signexperimentandt索heparameterswerede绰terminedasfollows:pH4;concentrationo竽fsodiummetaalumin充ate,750mg/L;stirri裥ngtime:6min.KEYWO缎RDSVancomycin;Sodiummetaaluminate缭;Chitosan;Coagulation;Flocculatio檫n万古霉素是一种
5、糖肽类抗生素，由微牯生物发酵法生产，是治疗由金葡球菌引起的严重感染的首选药物之一，临床上多使标用其盐酸盐。万古霉素发酵液预处理技术怔对后续分离纯化工艺操作以及产品的收率嘞和质量有较大的影响，目前国内、外针对此工艺的报道较少。凝聚和絮凝能有效改孩变细胞及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，提高过滤速率，有效除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量盈1。凝聚与絮凝方法操作简便易行，彀能耗低，所用设备及药品成本低廉，与超滤等其它方法相比较，有独特的优势，符踮合国内实际情况，是工业上常用的发酵液觥预处理方法。凝聚作用是指在某些电解颞质作用下，使扩散双电层的排斥电位降低漕，破坏胶体系统的分散状态，
6、使胶体粒子需聚集的过程2。本研究使用的硫酸铝硎、氯化铁、偏铝酸钠(NaAlO2)是儒常用的凝聚剂，也有报道用偏铝酸钠对循擒环冷却水进行处理效果较好3。絮糈凝作用是指在某些高分子絮凝剂作用下，袅悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成费粗大的絮凝团的过程2。本研究使用逑的聚丙烯酰胺、聚乙二醇、壳聚糖是常用的絮凝剂，其中壳聚糖是一种天然无毒的诉有机高分子絮凝剂，国内有很多关于用壳聚糖处理发酵液的研究46。1狩材料与方法材料与试剂万古霉素发酵液由本实验室提供；硫酸铝、氯化铁为囟天津市化学试剂三厂产品；偏铝酸钠天津大学化工厂(配成26%水溶液)提供；审聚丙烯酰胺为天津市元立化工有限公司(圩配成1%水溶液)
7、产品；聚乙二醇由天津市四通化工厂(配成1%水溶液)生产；爨水溶性壳聚糖由天津市光复精细化工研究诧所(配成%水溶液)提供。所用试剂均为爿分析纯。主要仪器JA21002型电子天平为上海精天电子仪器有限公司蜃产品；pHS3CW微机型酸度计为上谜海理达仪器厂产品；205型自动磁力搅枧拌器由美国VWR公司提供；SHBB95型循环水式多用真空泵由郑州长城科闻工贸有限公司生产；DFG801型电热鼓风箱为湖北黄石医疗器械厂产品；SS魇IPC2000型高效液相色谱仪为天竞津兰博实验仪器设备有限公司产品。发实验方法(1)凝聚、絮凝取40m肖l发酵液置100ml烧杯中，调节pH喻值，加入凝聚剂或絮凝剂，搅拌，于10
8、劢0ml量筒中静置2h。(2)抽滤坟吸取静置后的上层发酵液20ml弃去，嘲将剩余发酵液摇匀，抽滤，测滤速，以单跏位时间抽滤所得滤液体积计算，并观察滤掀液清亮程度。(3)沉淀物重量测定礞将滤饼干燥称重，减去干燥滤纸空重，计吴算沉淀物重量。(4)万古霉素含量测定将抽滤所得滤液稀释五倍，用高效液相色谱法7，8测定万古霉素含量。2结果与讨论凝聚剂与絮凝剂的初闽步筛选(1)凝聚剂与絮凝剂的加入对原始发酵液预处理效果的影响原始万古漆霉素发酵液的pH值约为，按照经验用量【加入不同凝聚剂与絮凝剂，作用效果明显缲(表1)。加入凝聚剂与絮凝剂后，滤速报、沉淀物重量、万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比以及滤
9、液澄清度均衡有不同程度的提高；除加入聚乙二醇的试样外，其它试样滤液中万古霉素含量变化割不大，这可能是由于含聚乙二醇的试样在娼絮凝过程中形成的一些絮凝团吸附、包含秘了少量的万古霉素，使其在抽滤时留在了翩滤饼中。(2)凝聚剂与絮凝剂的加入留对不同pH值发酵液预处理效果的影响为检验凝聚剂与絮凝剂在不同酸碱条件下氏的作用效果，将发酵液分为三等份，分别调节pH值为、，凝聚剂与絮凝剂用量动不变，结果见表2。由表2可知，pH骱值对预处理效果有一定的影响，酸性条件悠下的作用效果稍好。就一种凝聚剂或絮凝眼剂而言，pH值的变化对万古霉素含量影皿响并不大。经过上述两个实验的比较，初步选择偏铝酸钠、壳聚糖进行后续的实
10、验。偏铝酸钠用量对凝聚效果的影响踅表3表明，偏铝酸钠的用量影响凝聚效咔果。其添加量介于500和2000mg/L时滤速较大，沉淀物重量以及万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比在750mg/L时用量时达到最大值，俞滤液澄清度也随着偏铝酸钠用量的增加有所改善，而滤液中万古霉素含量则稍有降龛低，这可能是由于过量的凝聚剂吸附了发说酵液中微量的万古霉素。综合考虑，选择媵750mg/L为较适用量。pH值捍对偏铝酸钠凝聚效果的影响发酵液pH讨值对凝聚效果的影响见表4。表4结果显胱示，pH值的变化对絮凝效果有比较明显阀的影响。酸性条件下的滤速明显比中性及碱性条件下的滤速大，滤液澄清度较高；雾空白样的沉淀物
11、明显较少，万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比也较低蓣，提示加入偏铝酸钠能有效去除发酵液中霆的杂质。空白样还显示，在不同pH值条惊件下加入一定量的凝聚剂对万古霉素的产释量并无较大影响。综合考虑，选择pH值箅为4。表1凝聚剂与絮凝剂的加入对原始发酵液预处理效果的影响表3不同偏铝禹酸钠用量对凝聚效果的影响表4不同p卿H值对偏铝酸钠凝聚效果的影响pH值345678910空白1空白2滤速(呓ml/min)沉淀物重量(g)滤液澄圾清度+-+滤液万怒古霉素含量(g/L)万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比(%恚)用量750mg/L，搅拌3min；空白1：未调pH，未加偏铝酸钠；垮空白2：未调p
12、H，加偏铝酸钠。+：较澄清；+：澄清；-：浑浊。裂壳聚糖用量对絮凝效果的影响由表5可琚知，体系中壳聚糖的用量影响絮凝效果。增大絮凝剂的用量有助于充分发挥架桥作用，使胶粒絮凝，但用量过多反而会引起巳吸附饱和，胶粒表面被壳聚糖高分子覆盖嫔，使体系恢复稳定状态，所以随着壳聚糖聂用量的增加，滤液中万古霉素含量有所下萤降。从滤液澄清度来看，加入壳聚糖的滤洞液均不如加入偏铝酸钠的滤液清亮，絮凝锢物重量也明显低于用偏铝酸钠时的沉淀物重量，且万古霉素HPLC峰面积占总积郯分面积的百分比也普遍较低。综合各项指标，选择600mg/L的用量进行下一拘步实验。pH值对壳聚糖絮凝效果的柏影响如表6所示，酸性条件下的絮凝
13、效果优于碱性条件，从空白样可以看出，在佥不同pH值条件下加入适量的壳聚糖对万艽古霉素含量影响不大。由于使用壳聚糖处悼理发酵液的整体效果仍然不如偏铝酸钠，提故选择偏铝酸钠进行进一步实验。搅绥拌时间对偏铝酸钠凝聚效果的影响搅拌妙时间对凝聚效果的影响见表7。滤速、沉淀物重量以及万古霉素HPLC峰面积占昼总积分面积的百分比随搅拌时间的增加先褙增大后减小，搅拌时间在6min时效果啼较好，说明如果搅拌时间太短，凝聚剂与蚕溶液中的胶粒无法充分接触，达不到凝聚芪效果，但若搅拌时间过长，则凝聚在一起端的胶粒又会被打散，影响凝聚效果。榆偏铝酸钠凝聚最佳工艺条件的确定为选柁择最佳的凝聚工艺条件，在单因素实验的兰基础
14、上设计了正交实验，选用三因素三水平正交实验，以表5不同壳聚糖用量对絮凝效果的影响表6不同pH值对壳聚糖絮凝效果的影响表7搅拌时间对偏铝酸钠嚷凝聚效果的影响pH4，用量750mg倥/L，各个试样滤液均较澄清。万古霉素老HPLC峰面积占总积分面积的百分比为主要检测指标。其因素水平表、实验结果表及方差分析表见表8、表9和表10。由正交实验结果可知，pH值对凝聚效果硕影响最显著，用量次之，搅拌时间对凝聚效果影响不显著。最表8正交试验因素水平表表9正交试验结果表10方差分析够表来源离差自由度均方离差F值显著性仗显著显著不显著误差总和8佳凝聚条件为A2B2C2，即pH4，炀偏铝酸钠用量750mg/L，搅拌
15、时间脘6min。经验证，此条件下的凝聚效果猁较好，滤速/min，沉淀物重量达，滤鑫液较澄清，万古霉素HPLC峰面积占总皋积分面积的百分比达到%，万古霉素浓度沩为/L。万古霉素分离纯化工艺简述凝聚后的发酵液经过XAD16大孔树励脂纯化，所得洗脱液中万古霉素液相色谱涪峰面积可达总积分面积的%，万古霉素浓度达到/L。洗脱液经活性炭脱色、真空绁旋转蒸发浓缩、添加丙酮结晶、真空冷冻瘅干燥等工序制得成品，纯度达95%以上棺。3结论针对万古霉素发酵液预处芹理工艺，从六种凝聚剂与絮凝剂中选出偏馔铝酸钠和壳聚糖进行研究，发现偏铝酸钠暨作用效果较壳聚糖好。通过进一步实验，粪摸索出最佳凝聚工艺条件为pH4，偏铝酸钠
16、用量750mg/L，搅拌时间6m蜥in。【参考文献】1毛忠贵枋.生物工业下游技术M.北京：中国佩轻工业出版社，1999：412寇顾觉奋.分离纯化工艺原理M.北京榧：中国医药科技出版社，2000：103田颖.偏铝酸钠处理循环冷却水及坯配伍使用研究J.工业水处理，XX浸，23(8)：174刘清华，钱盅和，张伟国.用絮凝法处理L异亮氨酸发酵液J.加工技艺，XX(11)：545程丽，梁金钟.絮凝法预蝽处理大豆蛋白活性肽发酵液的研究J侃.大豆通报，XX(2)：176沈金玉，熊训浩，刘元帅.絮凝与膜超滤硝耦合预处理谷氨酰胺发酵液J.精细绺化工，2002，19(11)：6757SztaricskaiF,Bo钓rdaJ,PuskasMM,etal讧.Highperformanceli暇quidchromatography鼍ofantibioticsofvan突comycintypeJ.JAn缣tibiot,1983,36(12):1698陈代杰，李继安，邹韵华，等.万古霉素的研究开发J.中鹕国抗生素杂志，XX，29(1)：810 / 10