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1、丹参提取物中酚酸类成分稳定性及降解动力学研究_唐娜 LISHIZHENMEDICINEANDMATEIAMEDICAESEACH2013VOL24NO7 时珍国医国药2013年第24卷第7期 丹参提取物中酚酸类成分稳定性 及降解动力学研究 唐 1，21*2*2娜，杭太俊，叶正良，张文生 （1中国药科大学，江苏南京210009；2天士力制药集团股份有限公司，天津300402） 摘要：目的探索加温条件下丹参提取物中酚酸类成分的稳定性及含量变化规律。方法采用加温加速的方法考察丹参 提取物中酚酸类成分的稳定性，用UPLC方法测定丹酚酸类成分的含量，对实验数据用动力学方程进行拟合，找出变化规 丹参提取物
2、中丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B含量变化较大，降解符合动力学一级反应。结律。结果在加温加速条件下， 论丹参提取物生产过程中，为减少酚酸成分损失应尽量减少加热时间，且不宜用单一的酚酸成分含量作为质量控制指 标。 关键词：丹酚酸;稳定性;降解动力学DOI标识：doi:103969/jissn1008-0805201307038 0805(2013)07-1631-03中图分类号：2842文献标识码：A文章编号：1008-丹参为唇形植物丹参（SalviamiltiorrhizaBge）的干燥根和根 茎，味苦，性微寒，归心、肝二经，具有活血化瘀、凉血消肿、清心除 恒湿箱（德国3M公司）；METTLETOL
3、ED水分测定仪；超纯水 仪MilliQIntegral5eagentWaterSystem（美国MILLIPOE公司）。 方法 烦的功效。丹参中主要包含以丹参酮为代表的脂溶性成分和以丹酚酸为代表的水溶性成分。现代药理研究证明，丹参酚酸类成2 分具有改善微循环、抑制血小板聚集、抗氧化、增加冠脉流量及心21丹酚酸含量检测方法的建立 13 。由于其对211供试品溶液的制备精密称定01g丹参提取物，肌供氧量等作用，是治疗冠心病的主要活性成分水溶 心血管系统的特殊作用，已被广泛应用于临床，成为国内外现代解，定容至10ml；过022m微孔滤膜，取续滤液注入超高效液化中药研究的热点品种之一。目前，从丹参中分
4、离出的酚酸类成相色谱仪。分已有20多种，其中，丹参素和丹酚酸B在对心脏的保护和抗氧212对照品溶液的制备分别精密称取丹参素645mg，原儿 4 化方面都表现出很强的活性，常常是丹参制剂质量控制的指茶醛148mg，迷迭香酸171mg，丹酚酸B810mg，用甲醇溶解标性成分。从结构上看，除了一些简单的苯甲酸，如原儿茶醛、原并定容至10ml。 21儿茶酸等，大部分丹酚酸都是咖啡酸缩合物。由于酯键的存在，213色谱条件采用ACQUITYUPLCHSST3（18m， 多数缩合酚酸的稳定性较差，高温条件下，大分子酚酸易降解转mm100mm）色谱柱，以01%甲酸水（A）乙腈（B）为流动相 5 化成丹参素和原
5、儿茶醛等小分子酚酸。本文作者在进行丹参进行线性梯度洗脱（016min，流动相A由92%降低至81%；提取物的提取、浓缩及强制降解试验过程中，发现丹参素、原儿茶1618min，流动相A由81%降低为782%；1861min，流 醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量发生了不同变化。其中，丹酚酸B的稳定性以及降解途径已见诸多报道，丹参素、原儿茶醛、迷迭动相A由782%降低为70%；618min，流动相A由70%降低 流动相A由55%降低到10%；到55%；8085min， 香酸的稳定性却鲜少有文献报道。为了弄清它们的含量变化规85105min，流动相A保持10%；10511min，流动相由 律，对生产工艺进
6、一步改进提供实验支持，本作者对四种酚酸10%上升到92%；1112min，流动相A保持92%），流速0340条件下降解动力学进行了初步研究，结果表明丹参素、原儿ml/min，柱温40，检测波长280nm。供试品溶液的色谱图见图茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的降解符合动力学一级反应。1材料、试剂与仪器丹参提取物（实验室自制）；丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品均购至中国药品生物制品色谱用试剂为色谱纯，其余试剂均检定所。色谱用水为超纯水，为分析纯。 美国WatersAcquity超高效液相色谱仪（UPLC），包括二元超高压溶剂系统、自动进样器、柱温箱、紫外检测器；404型恒温
7、 11-20;收稿日期：2012-作者简介：唐 * 1 。 05-08修订日期：2013- 1丹参素2原儿茶醛3迷迭香酸4丹酚酸B 图1 供试品UPLC图 )，娜(1989-女(汉族)，江苏淮安人，现为中国药科大学学 生，硕士学位，主要从事复方丹参提取物稳定性研究工作 )，通讯作者简介：杭太俊(1963-男(汉族)，江苏东台人，现任中国药科)，通讯作者简介：叶正良(1967-男(汉族)，浙江金华人，现任天津天士 214 大学教授，博士学位，主要从事药品质量控制研究工作 * 力之骄药业研究员，博士学位，主要从事中药药学分析研究工作 4，8，16，20倍，线性关系考察取对照品溶液稀释2，各吸 取2
8、l注入超高效液相色谱仪，测定峰面积。分别以各色谱峰面积积分值（Y）对浓度（X）进行线性回归。结果见表1。 精密度试验取丹参提取物配制成供试品溶液，连续进样 215 1631 时珍国医国药2013年第24卷第7期 LISHIZHENMEDICINEANDMATEIAMEDICAESEACH2013VOL24NO7 6次，测定各成分峰面积积分值。结果丹参素、原儿茶醛、迷迭香从图1可以看出，在40条件下，丹参素和原儿茶醛含量逐 025%，044%，049%。渐升高，酸、丹酚酸B的SD值分别为063%，迷迭香酸和丹酚酸B含量逐渐降低 。 实验结果表明：仪器精密度良好。 表1 4个组分峰面积及浓度的线性
9、关系 回归方程 Y=410X70463Y=2107X30408Y=6106X+258776X+5325 r1000100009990999 0029 组分线性范围/gml1 3226444丹参素 741481原儿茶醛 851707迷迭香酸 4058103B 216 稳定性试验采用精密度项下配置的供试品溶液，分别在 0，25，5，75，10，15，20h进样测定峰面积，进行稳定性试验，每个时间点分别进样2针，以平均峰面积计算各自的SD。实验结果表明：供试品溶液20h内稳定。217 “211”重复性试验按项中供试品制备方法制备6份供 “213”试品溶液，按项下方法测定，每份供试品溶液进样2针， 图
10、2丹参素剩余浓度（lnc）对时间（t） 作图 记录色谱图，以平均峰面积计算含量，并计算其含量的SD值。 丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B6次进样结果的SD值分11%，10%，11%。结果表明，别为09%，重复性良好。218回收率试验分别精密称取供试品005g，共9份，加入10ml容量瓶中，取精密项下所测得的各成分含量作为加入对照 100%、120%的对分别精密加入供试品含量的80%、品的依据， 照品各3份，加水适量，超声使溶解，放冷，定容至刻度，摇匀，过 022m微孔滤膜，分别检测，每份样品进样2针，以平均峰面积计算各成分测得量，计算回收率和SD。试验测得丹参素、原儿 9814%，茶醛、迷
11、迭香酸、丹酚酸B的回收率分别为9876%，9881%，10166%。22 丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B降解动力学模型的 1 013mgml1建立分别配置浓度为048mgml的丹参素、 013mgml1迷迭香酸、043mgml1丹酚酸B水原儿茶醛、 1 溶液（1/15molLpH=492磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲 分装到10个WATES样品瓶中，密封，放置于40恒液）25ml， 图3原儿茶醛剩余浓度（lnc）对时间（t） 作图 图4迷迭香酸剩余浓度（lnc）对时间（t） 作图 温箱内，每天取一个样，测定样品瓶中剩余标准品含量。 23丹参提取物在40环境下短期稳定性取丹参提取物40g，5、1
12、0天取样，密闭置于40恒温箱中，第0、检测供试品水分及 酚酸类成分含量，折干后以固含量计，实验设置两个平行组。3 结果与分析31丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B降解动力学模型的建立用图解法确定反应级数，分别以丹参素、原儿茶醛、迷迭香丹酚酸B剩余药物的浓度（InC）对时间（t）作图36。结果酸、 40条件下，显示，丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的InC/nc与t均呈线性关系，r值大于098，这是动力学一级反应的重要特征。一级动力学方程如（31） lnct=kobst+lnco 组分 丹参素原儿茶醛迷迭香酸丹酚酸B 图5表2 丹酚酸B剩余浓度（lnc）对时间（t）作图40不同酚酸类成分回
13、归方程及K值 r值0992098909900984 5227 K值0025400063002440 047 t是反应时间；C0和Ct是反应物的初始浓度和t时刻其中， 浓度；kobs是一级降解动力学常数，其值大小反映降解的快慢。40条件下丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B降解动力学曲线如图25。 40，pH=492条件下，从试验结果可以看出，丹参素、原儿 茶醛、迷迭香酸以及丹酚酸B均有不同程度的降解，降解速率丹酚酸B丹参素迷迭香酸原儿茶醛。 32丹参提取物40环境下短期稳定性根据ICH关于影响因 选择40作为短期稳素试验的要求和丹参提取物本身的性质，定性考察的条件。 回归方程 Y=00254X
14、07324Y=00063X2036Y=00244X2023Y=0047X08688 图640酚酸类成分含量净变化 1632 LISHIZHENMEDICINEANDMATEIAMEDICAESEACH2013VOL24NO7 时珍国医国药2013年第24卷第7期 33 降解机理推测丹酚酸B在水溶液不稳定，易降解，对此已 6 有大量文献报道。倪力军等在研究加热方式对缩合酚酸质量 该严格控制温度和加热的时间。 由于酚酸类成分，在加热的过程中不稳定且存在相互转化的关系，所以控制丹酚酸类制剂的质量，不宜单独用丹酚酸B或者迷迭香酸作为指标。 本实验只考察了四种酚酸标准品在40条件下的降解动力不能全面反映
15、丹参提取、浓缩的全过程。在后续实验中，还应学， 该结合生产工艺的具体要求，设计不同温度下的降解动力学实验。 pH、除了温度，含水量等因素对于丹参提取物的稳定性也有 影响，应该在后续实验中进行全面研究。 影响时，发现丹酚酸B对温度很敏感，加热方式不同，提取液中 7 丹酚酸B的含量差异很大。张军等研究发现丹酚酸B不仅对温度敏感，还对pH敏感，丹酚酸B在pH2条件下比较稳定，在 5 pH12条件下短时间内就迅速消失。郭永学对丹酚酸B的稳定性和降解动力学进行了系统研究，研究表明丹酚酸B的降解 pH越大，pH=常数随温度升高而增大，丹酚酸B的稳定性越差，2时最稳定；90不同pH条件下，丹酚酸B的降解符合
16、一级动力 学反应，降解半衰期只与时间有关，与初始浓度无关。实验还对丹酚酸B降解产物进行了结果鉴定，共鉴定出了丹参素、原儿茶醛等14种降解产物，并推测酯键的酸碱水解是丹酚酸B降解的主要途径。 参考文献： 1张艳军，张发艳，范英昌丹酚酸B、丹参酮A对家兔动脉粥样硬 J天津中医药，2005，22（4）：328化模型内皮细胞功能的影响 迷迭香酸和丹酚酸B具有相似的酯键结构，可以推测，酯键 2王蓉，原永芳丹酚酸B药理作用的研究概况J中医药导报， 的水解也是造成其不稳定的主要因素。这一推测在笔者后续进 迷迭香酸在酸性条件下水解生3行的强制降解试验中得到了验证， 浦锡娟，徐凯琳丹参的药理作用研究进展J临床医
17、学工程， 。成了丹参素和咖啡酸2009，16（8）：154，加速条件下提取物中的丹参素和原儿茶醛和单体表现出了4FrancisFYLam，JohnHKYeung，YiuWKwan，etalSalvianolicacid 8 不同的含量变化规律。毛声俊等研究也表明，在加速试验条B，anaqueouscomponentofdanshen（Salviamiltiorrhiza）relaxesrat对照品溶液中丹参素的含量随着时间降低，注射液中的丹件下， 参素含量升高，与本作者研究结果相符。推测加速条件下，提取 coronaryarterybyinhibitionofcalciumchannelsJE
18、uropeanJournalofPharmacology，2006，553（13）：2402011，17（4）：130 丹参素5郭永学丹酚酸B降解机理及纯化工艺研究D大连：大连理工物中丹酚酸B等缩合酚酸降解生成丹参素和原儿茶醛， 2007大学博士论文，和原儿茶醛生成的速率大于其自身降解的速率，使得含量不降反升。 4总结 以往用高效液相色谱法测定这四种成分的含量，需要40911 80min。本实验建立的超高效液相色谱测定含量的方法，仅 6倪力军，邬科芳，张立国加热方式对丹酚酸提取物质量的影响 J中药新药与临床药理，2006，17（1）：55 7张 军，王风云，詹丽玲，等丹参药材提取液中丹酚酸B稳
19、定性影2005，30（10）：789响因素的考察J中国中药杂志， 8毛声俊，侯世祥，唐昌炯，等丹参素在加温加速条件下的含量变化 仅需要12min，就能完成四种成分的分离和分析，与HPLC法相中国中药杂志，2003，28（3）：220规律研究J UPLC的分离效果和分析效率均有了大幅度提高，比，预测UPLC9PANYingni，YuanDan，FuWenweiSimultaneousdetermination在中药成分的分离和分析中将得到广泛应用。of4watersolublecomponentsindashencontaininginjectionsby 40提取物中的丹参素和原儿茶醛含从实验结果可以看出，HPLCJJShenyangPharmUniv，2004，21（3）：196 10游勇基，量升高，而对照品溶液中的丹参素和原儿茶醛含量降低。推测是程广强，陈铭辉丹参注射剂中丹参素、原儿茶酸、原儿茶 2004，24（1）：46醛和丹酚酸B的同时测定J药物分析杂志，丹酚酸B、迷迭香酸等缩合酚酸水解产生了丹参素和原儿茶醛等11杨伟，李永吉PHPLC测定丹参中4种水溶性成分的含量小分子酚酸。 丹酚酸类成分对温度都比较敏感，在提取、浓缩的过程中应 J中国中药杂志，2006，31（23）：2008 1633