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1、温固化水凝胶负载骨髓基质干细胞修复兔关节骨软骨缺损实验探究 摘要目的：探讨温固化水凝胶作为骨髓基质干细胞的载体修复软骨缺损的可行性。方法:将培养的骨髓基质干细胞与400g/L浓度的温化水凝胶混合后移植到兔膝关节软骨缺损中，分别于术后4、8、12周观察大体标本及组织学修复结果。结果：实验组的缺损为透明软骨修复。而单纯材料组和空白对照组则以纤维组织修复。参考Wakitani制定的组织学评分标准，Pluronic F-127组和空白对照组的组织学评分在各个时期无显著的差异（P0.05）,而实验组和空白组在各个时期均存在显著的差异（P0.05）。结论：Pluronic F-127可作为软骨组织工程良好
2、的支架材料。 关键词温固化水凝胶；骨髓基质干细胞；组织工程；软骨缺损 中图分类号R318.5R684文献标识码A文章编号1008-6455（2008）03-04 The experimental study on bone marrow stromal cells loaded temperature dependent hydrogel on repair of full-thickness defects of rabbit articular cartilage WANG Jin-ming,ZHANG Qing-guo,ZHAGN Jiao （School of Clinical Med
3、ical College Southeast University， Nanjing 210009，Jiangsu，China） Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of the temperature dependent hydrogel loading bone marrow stromal cells for repairing articular cartilage defects. Methods Cultured bone marrow stromal cells and 4OOg/Lhydrogelmixture wa
4、s transplanted to the knee articular cartilage defects in rabbits, after 4, 8 and 12 weeks, Repair of articular cartilage defect was investigated by gross observation and HE stain of histological specimens.Results In the experimental group the defect was repaired by hyaline cartilage. While in the P
5、luronic F-127 group and control group the defect was repaired by fibrous tissue. Referencing Wakitani developed histological grading scale . Between the Pluronic F-127 group and the control group in the histologic score in each period there was no significant difference (P 0.05), while between the e
6、xperimental group and control group in each period there was significant difference (P 1.2.5 结果检测：分别于术后4、8、12周空气栓塞处死动物，取材，行大体及组织学观察：大体观察：膝关节活动情况，关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无增厚粘连及关节面缺损修复的平整度及光泽度；组织学检测：取材后10%福尔马林固定48h,5%硝酸脱钙液脱钙24h,冲洗、系列酒精脱水、石蜡包埋、5m切片、HE 染色光镜观察 1.2.6 统计学分析：参考Wakitani制定的组织学评分标准5（表1），所有实验结果计量资料以xs表示
7、,采用SPSS11.5软件进行统计分析，值取0.05。 2结果 2.1 功能评价：术后3天内，兔膝关节活动受限，活动较少。随后运动逐渐增加，屈曲姿态和跳跃动作逐渐正常，1周内恢复正常。 2.2 大体形态观察：膝关节无红肿，关节囊无明显增生肥厚，无挛缩、粘连；关节液清亮。 2.2.1 A组：术后4周，填充物与周围正常软骨分界清楚，大部分呈淡红色半透明，缺损填充物周边部见部分呈乳白色；填充物表面平整光滑，与周围正常软骨连接良好，高度基本一样或略微凹陷；触之微韧，与周围正常软骨能分离。术后8周，填充物与周围软骨分界不明显，呈乳白色，与正常软骨颜色接近，表面光滑，与周围软骨连接好，高度与周围软骨基本一
8、致；触之质韧，与周围正常软骨不能分离。术后12周，填充物与周围正常软骨分界模糊，呈乳白色，填充物表面平整光滑，与周围软骨连接好，高度与周围软骨基本一致；触之质韧，与周围正常软骨基本一致，与周围正常软骨不能分离（图1）。 2.2.2 B组：术后4周，填充物与周围正常软骨分界清楚，大部分呈半透明状，周边部见部分呈白色，填充物表面平整光滑，与周围正常软骨连接良好，高度基本一样或略微凹陷；触之微韧，与周围正常软骨能分离。术后8周，填充物与周围软骨分界不明显，呈白色，表面略粗糙，与周围软骨连接好，高度略微低于周围正常软骨；触之质韧，与周围正常软骨不能分离。术后12周，填充物与周围正常软骨分界不清楚，呈白
9、色，填充物表面凹陷不平，与周围软骨连接好，高度略低于周围正常软骨；触之质硬，与周围正常软骨不能分离(图2)。 2.2.3 C组：术后4周，缺损区由白色组织填充，可见血凝块甚者部分缺损区骨质裸露无组织覆盖，表面粗糙，与周围正常软骨连接不佳，高度低于周围正常软骨；触之软，与周围正常软骨能分离。术后8周，缺损区由白色组织填充，周边可见部分裸露骨质无组织覆盖，表面粗糙不平，高度低于周围软骨，触之质韧，与周围正常软骨不能分离。术后12周，缺损区由白色组织填充，周边可见部分裸露骨质无组织覆盖，表面粗糙不平，高度低于周围软骨，触之硬，与周围正常软骨不能分离（图3）。 2.3组织学观察 2.3.1 A组：术后
10、4周，缺损填充区可见增殖的软骨细胞，细胞排列不规则，成簇生长，细胞形态较少，基质较少，表面可见部分纤维样组织，可见不连续的软骨下骨(图4)。术后8周，缺损填充区可见软骨细胞增多，基质较多，细胞周围可见典型的陷窝样结构，软骨下骨连续性好(图5)。术后12周，缺损填充区形态与周围正常软骨相似，细胞形态、排列，基质量接近周围正常软骨(图6)。 2.3.2 B组：术后4周，缺损填充区主要被纤维样组织覆盖，可散在见软骨细胞，软骨下骨生成较少。术后8，12周，缺损填充区同样主要为纤维样组织覆盖，软骨下骨逐渐增厚与正常接近(图7)。 2.3.3 C组：修复各个时期，缺损区均为纤维组织覆盖，无软骨细胞。软骨下
11、骨逐渐增厚(图8)。 2.4统计分析结果：A、B、C三组在4、8、12周时所采集的数据，以xs表示（表2）,采用SPSS11.5软件进行统计分析，对数据显著性检验采用两样本均数比较的t检验。P0.05为差异显著。实验组（A组）和空白对照组相比在各个时期均有显著性差异(P0.05 ),单纯材料组（B组）和空白对照组相比在各个时期无显著性差异（P0.05）。 3讨论 成熟的关节软骨损伤后其自我修复的能力十分有限，一般认为直径小于3mm的缺损可得到部分或全部的修复，而直径大于4mm的缺损一般不能以透明软骨形式修复6。本实验设计了约直径4mm、深3mm的关节软骨缺损模型。 软骨细胞培养扩增修复软骨缺损
12、多有报道,但细胞获取及扩增均较困难7,且软骨细胞修复软骨下骨效果不佳。BMSCs 能够根据微环境信号的指令分别分化为成骨细胞和软骨细胞, 适合于伴有软骨下骨损伤的软骨缺损修复。由于关节腔内的乏氧环境和关节液中各种细胞因子的作用, 促使骨髓BMSCs 向软骨细胞分化形成软骨组织。而缺损底部邻近髓腔, 较高的氧分压促使骨髓BMSCs 向成骨细胞转化形成骨小梁。软骨和骨小梁的形成有利于修复组织与邻近正常组织的结合。这样, 软骨层及软骨下层的骨缺损都能修复而形成正常的关节结构8。 本实验所应用的聚氧化乙烯聚氧化丙烯聚氧化乙烯(PEOPPOPEO) 三嵌段共聚物具有良好的生物相容性和良好的生物降解性9-
13、10。它最大的特点是浓度大于100g/L的水溶液都有一个凝胶化温度, 当温度低于凝胶化温度时, 粘度很低,为粘性流体, 温度超过凝胶化温度时, 粘度急剧增高, 变为凝胶。400g/L时凝胶化温度约为4。因此我们可在低温下将此材料和细胞混合后注射至缺损区，操作上有了极大的便利。本实验结果示聚氧化乙烯聚氧化丙烯聚氧化乙烯(PEOPPOPEO) 三嵌段共聚物与骨髓基质干细胞（BMSCs）复合物能以透明软骨方式修复关节软骨缺损，而单纯材料组和空白对照组则以纤维样组织修复缺损，不能以透明软骨方式修复。 因此温固化水凝胶聚氧化乙烯聚氧化丙烯聚氧化乙烯(PEOPPOPEO) 在软骨组织工程中将有良好的应用前
14、景。 参考文献 1ODriscoll SW. The healing and regeneration of articular cartilageJ.J Bone Joint Surg (Am), 1998,80(12): 1795. 2Minas T , Frcs M , Nehrer S. Current concepts in the treatment of articular cartilage defects J. Orthopedics, 1997, 20: 525-538. 3Faulkner DM, Sutton ST, Hesford JD, et al. A new s
15、table pluronic F68 gel carrier for antibiotics in contaminated wound treatmentJ. Am J Emerg Med,1997,15(3)20. 4夏万饶.组织工程化组织形成的最佳细胞浓度和最佳形成时间的实验研究J.中华修复重建外科杂志，1999，13（4）：244-248. 5Wakitani S , Goto T , Pineda SJ ,et al. Mesenchymal cellbased repair of large ,full - thickness defects of articular cartic
16、ular cartilageJ. J Bone Joint Surg (Am),1994,76:579-592. 6Yang Y,Lu MA.Joint cartilage defect research progress that repairJ.Guangxi Yixue (Guangxi Med J) 2002，24(12):2027-2031 7Brittberg M, Tallheden T, Sjogren JE, et al. Autologous chondrocytes used for articular cartilage repair J. Clin Ortho and
17、 Rel Res, 2001, 391: 337-348. 8李 强, 孙正义, 王栓科, 等. 骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质修复兔膝关节全层软骨缺损的实验J. 第四军医大学学报, 2004,25(15)：1375-1378. 9李石保，杨维东，唐立辉，等.温固化水凝胶的制备和应用J. 第四军医大学学报，2001，22(4)：306-308. 10张艳, 柴岗, 刘伟, 等.组织工程软骨构建的临床初步研究J. 中国美容医学, 2005,14(5)：530-531. 收稿日期2007-12-15修回日期2008-03-10 编辑/张惠娟 注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。” 9