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1、产自嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM-5146）的热稳定-半乳糖苷酶的纯化、特性表征及其底物专一性研究摘要：采用色谱分析法，使用苯基琼脂糖凝胶CL-4B柱，纯化嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM-5246）产的一种胞外热稳定-半乳糖苷酶，获得纯组分。此酶的比活力从1.03U/mg蛋白增长到400U/mg蛋白，大约增长了389倍。采用SDS-PAGE电泳和凝胶过滤，测得此纯化酶的分子质量分别是79.9kDa、165.9kDa，因此推测有二聚特性。纯化的-半乳糖苷酶是一种非糖基化蛋白，其等电点是4.9。纯化的酶的最适pH和最适温度，分别是6.5-7.0和65。-半乳糖苷酶能在较广的pH范围内（39）保持稳定，在
2、70下，失活半衰期是30分钟。 此-半乳糖苷酶的部分N末端序列与先前报导的嗜热脂肪芽孢杆菌（NUB3621）产的-半乳糖苷酶表现出显著的同源性（相似度达80%）。用圆二色谱法（CD）测定酶的二级结构，表现出/蛋白结构，并且温度处在转变温度上下时，其构想形式减少。纯化的酶与对硝基酚-D-吡喃半乳糖（pNPG）的阿仑尼乌斯二相图在55出现拐点，与蜜二糖、棉籽糖和水苏糖的阿仑尼乌斯二相图在50出现拐点。此酶能水解-1-3、-1-4和-1-6半乳糖苷键，而不能水解-半乳糖苷键。合成底物pNPG和oNPG与天然底物如蜜二糖、棉籽糖和水苏糖相比，Km值更低而Kcat值更高。关键词：嗜热脂肪芽孢杆菌（NCI
3、M-5146）；-半乳糖苷酶；热稳定性酶；纯化；二级结构1. 前言 -半乳糖苷酶（-D-半乳糖苷酶 galactohydrolase E.C.3.2.1.22）是一种外切糖苷酶，主要是切断各种底物中的末端-1-6-D-半乳糖残基，包括棉籽糖族的寡糖：棉籽糖、水苏糖、蜜二糖、毛蕊花糖和多聚糖：半乳甘露聚糖、刺槐豆胶和瓜尔豆胶，也作用于复合糖、糖蛋白和鞘糖脂。此外，已经知道了某些-半乳糖苷酶能够催化转糖基化反应，特别是在较高的底物浓度。而此酶的利益源自于它们很有潜力的技术工艺和医药应用1,2。目前，-半乳糖苷酶最重要的工业应用是在甜菜糖工业、制浆造纸工业、大豆食品加工和动物饲料加工在人类医药方面，
4、当-半乳糖苷酶应用于血型系统转换、法布瑞氏症的治疗和异种器官移植，其不断增长的利益显而易见3,4。-半乳糖苷酶已能够从各种各样的来源中分离并纯化，包括植物、动物和微生物5。最近，嗜热和极度嗜热微生物产的一些-半乳糖苷酶已被分离和特性表征6,7。嗜热脂肪芽孢杆菌 NUB 36218、栖热菌neapolitana9和梭菌stercorarium10产的-半乳糖苷酶的克隆及序列分析已经报道。同样地、大米11和里氏木霉12中的-半乳糖苷酶的晶体结构也已解析。但是，很少的信息可以用在酶结构和催化机理，以及产自嗜热微生物的-半乳糖苷酶的抗热性的机理13。在早先的文章14中，我们发现菌种嗜热脂肪芽孢杆菌 N
5、CIM 5146 合成-半乳糖苷酶非常有效率。为了研究酶的结构功能关系，有必要通过简单而有效率的纯化方法来获得大量的单纯的形态的-半乳糖苷酶。在当前的研究中，我们叙述了一种单独的色谱分析法以纯化嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的-半乳糖苷酶。纯化的酶用来表征它的生化和分子特性，也表征其对低聚和高聚底物的底物专一性。2. 材料和方法2.1材料对硝基酚-D-吡喃半乳糖（pNPG），邻硝基酚-D-吡喃半乳糖（oNPG），棉籽糖，水苏糖，蜜二糖，3-O-D-吡喃半乳糖基-D-半乳二糖，4-O-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃半乳糖和其他所有底物，葡糖糖，半乳糖，甘露糖，乳糖，聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶
6、过滤标记物，考马斯亮蓝 R-250与溴酚蓝，购自Sigma化学公司，美国。葡聚糖凝胶-300，苯基琼脂糖凝胶CL-4B，Pharmacia，瑞典，葡糖糖氧化酶过氧化酶（GOD-POD）试剂盒，当地化学试剂公司。所有的其他化学试剂均是分析纯。2.1材料2.2.1. 微生物和培养条件嗜热细菌嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM）用于当前研究由前述保存14。为了纯化-半乳糖苷酶，菌落生长在含有0.2%（w/v）半乳糖作为碳源，0.3%（w/v）K2HPO4，0.1%（w/v）KH2PO4和0.3%（w/v）酵母提取物作为氮源的培养基上。培养基最初的pH是7.0。在含有50ml培养基的250ml的锥形瓶中进行发
7、酵。瓶中注入12h菌龄的由前述准备好的菌种（2%）14，在60下置于200rpm转速的旋转振荡器上培养24h。发酵结束后，生物质由离心分离（7000g。10min）,上清液作为胞外酶的来源。2.2.2. -半乳糖苷酶鉴定和蛋白质测定由前所述，-半乳糖苷酶活性测定是通过测定在65下10min水解对硝基酚-D-吡喃半乳糖的速率14。当其他低聚半乳糖和多聚糖作为底物时，用Nelson方法测定产生的还原糖15。而蜜二糖水解释放的葡糖糖用葡糖糖氧化酶过氧化酶方法（GOD-POD）来预测16。一个单位的酶活力定义为：在测试条件下每分钟释放1mol产物（对硝基酚，邻硝基酚或半乳糖/葡糖糖）所需要的酶量。低聚
8、半乳糖的水解产物用波层色谱法（TLC）（预涂硅胶板，Merck）定性分析。薄板在含有正丙醇：乙酸；水（1:1:0.1，v/v/v）为溶剂体系的饱和蒸汽室中室温下培养。培养之后，薄层板喷撒以1%（w/v）溶解在含10%（v/v）的磷酸的无水乙醇的-萘酸、，然后在烘箱保持1405min，以可视化糖斑点。发酵液和纯化的酶制剂的蛋白质浓度用Lowry法测定17。同时280nm下的吸光度测定使用牛血清白蛋白作为标准。纯化的酶制剂的中性糖含量用Dubois的苯酚-硫酸法测定18。2.2.3. -半乳糖苷酶的纯化 无细胞培养液通过超滤过滤装置，用YM-30（截止分子质量 30,000Da）的膜过滤器浓缩10
9、倍。浓缩后的培养液用冷的乙醇分馏。从50-90%饱和馏分中获得的沉淀物通过离心分离并用最少的25mM的磷酸盐缓冲液（pH7.0）重新溶解来收集。相同的酶样品用于疏水性柱色谱分析，使用预先用25mM的磷酸盐缓冲液（pH7.0）平衡的苯基琼脂糖凝胶CL-4B柱（30ml基柱）。层析柱用20基础体积的上述缓冲液彻底洗干净。流速为20ml/h的磷酸盐缓冲液（25-0ml，4倍基柱体积）的直线斜率减小，并且收集到大约3.0ml的馏分，则洗脱结束。表现出活性的馏分通过合并、超滤浓缩，以用于进一步研究。除非另外提到，整个纯化过程是在4下进行。2.2.4. 电泳技术和N-末端测序根据Laemmli描述的的方法
10、，SDS-PAGE（12%）用垂直凝聚平板装置在pH8.3下操作19。在未变性的条件下，天然的PAGE（10%）完成结果相似。用考马斯亮蓝R-250（0.2%，w/v）或银染色（0.2%，w/v）能检测到蛋白带。等电点聚集使用BIO-RAD Rotofer 电泳池（2，3h，10瓦功率），在pH范围3.0-10.0的含有两性电解质的pH梯度环境下进行。纯化酶的等电点用Chinnatambi等20的方法测定，使用小规模密度梯度等电聚焦装置，用pNPG作底物来显示-半乳糖苷酶带。为N-末端测序分析，使用半干吸收系统（Nova Blot, Pharmacia Biotech, 瑞典）在52mA恒定电
11、流下30分钟，蛋白质从SDS-PGGE点转移到聚偏氟乙烯膜（PVDF, Bio-Rad, Richmond,CA, 美国），并用考马斯亮蓝R-250着色剂使蛋白带可视化。使用PROCISE测定酶的前10个残基的N-末端氨基酸序列，蛋白质测序系统产自印度新德里免疫学国际组织的PE Biosystems公司。 2.2.5. 分子质量测定（Mr）根据Andrews描述的方法，纯化的-半乳糖苷酶的原生分子质量通过凝胶过滤法估测21。凝胶过滤柱葡糖糖凝胶S-300（1cm*150cm）用磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.0）平衡，用凝胶过滤标准分子质量标记物：牛血清蛋白（66kDa）、乙醇脱氢酶（150
12、kDa）、-淀粉酶（200 kDa）、Apoferetin（443kDa）和甲状腺球蛋白（669kDa）进行校准。过滤柱的空隙容积用蓝色葡聚糖（2000kDa）测定。根据Weber和Osborn22，亚基分子质量使用Sigma 高分子质量标记物进行SDS-PAGE电泳测定。2.2.6. 圆二色性（CD）和二级结构分析 不同温度下， 天然-半乳糖苷酶的二级结构用CD光谱法测定。用250L样品固定器和0.1cm路径长度的样品池，记录在Jasco-710分光偏振计的远紫外区（190-250nm）上。酶样品的温度用循环水浴控制在30-70。二级结构的构成用CONTINLL 算法测定23。2.2.7.
13、pH和温度效应通过用50mM的柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH3.0-7.0）和磷酸钾缓冲液（pH6.0-9.0）试验照标准方法-半乳糖苷酶在pH 3.0-9.0范围的活性来测定pH对酶活力的影响。PH稳定性测定时，在相同的pH范围内将预先培养的酶样品在上述的缓冲液中室温下保持12小时，立即用等份试样，按标准分析方法测试残留的酶活力。-半乳糖苷酶的最适温度是在30-75下进行试验测定的。温度稳定性测定是在相同的温度范围，培养酶样品60分钟，在合适的时间间隔后取出等份试样（100l）用标准分析方法测定残留酶活力。2.2.8. 金属离子、糖和抑制剂的效应将适当稀释的酶（100l）加入到50mM预先添加各种
14、金属盐、糖和抑制剂的磷酸盐缓冲液（pH7.0）在室温下保持10分钟，随后按标准分析方法测定残留酶活力。竞争性抑制剂的抑制常数用Dixion方法测定24，非竞争性抑制剂的抑制常数用Cornish Bowden25 方法测定。2.2.9. 底物专一性和动力学研究 -半乳糖苷酶对各种合成的和天然的配糖体的相对底物专一性是在底物浓度为5.85mM下测定的。通过改变底物浓度测定各种糖苷的最初水解速率，变化范围：pNPG和oNPG是0.0660.399mM，蜜二糖是0.251.5mM，棉籽糖、水苏糖和3-O-D-半乳二糖分别是0.42.4，0.21.2，0.1460.730mM。检测是在65下标准检测环境
15、下进行的。动力学平衡常数，Km，Vmax和Kcat是通过米氏方程和双倒数作图法图解得到26。不同糖苷的活化与络合的热力学参数通过温度相关试验研究测定。pNPG，蜜二糖，棉籽糖和水苏糖的速率常数，Km和Kcat是在3070的不同温度下，以上述浓度范围，通过改变底物浓度而测定。3. 结果和讨论3.1. -半乳糖苷酶的纯化和性质-半乳糖苷酶用超滤、乙醇分馏，之后用苯基琼脂糖凝胶CL-4B柱疏水性色谱分析，从天然培养基上清液中纯化得到。乙醇分馏的酶引入苯基琼脂糖凝胶CL-4B柱时不用硫酸铵。主要的酶活力用逆向梯度的磷酸钾缓冲液（25-0mM）在单独一个峰内洗脱，在12.5mM磷酸盐缓冲液达到酶活力峰值
16、。纯化各步骤的蛋白质电泳图在图1A中显示，-半乳糖苷酶的纯化步骤总结在表1。纯化的-半乳糖苷酶的比活力达400U/mg，是纯化前388倍。以前，-半乳糖苷酶的纯化通过沉闷又耗时的多级纯化程序完成的27，28。但是，我们发明了相对简单又高再生的单步色谱分析程序，省略了离心分离、浓缩和渗析步骤。图1. 嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的纯化-半乳糖苷酶的Native、等电点聚焦和SDS电泳图。（A）Native电泳图：每一步纯化获得的-半乳糖苷酶活力在pH3.8未变性的条件下的电泳片段。条纹1：浓缩的培养滤液。条纹2：酒精沉淀的:酶。条纹3：苯基琼脂糖洗脱的酶。（B）等电点聚焦图：纯化酶（
17、50g）在有章节2.2所述两性电解质（pH310）的聚丙烯酰胺管形凝胶中的电泳图。（C）SDS电泳图：纯化酶（10g）于聚丙烯酰胺平板凝胶中在变性条件下，存在标准分子质量标记物的电泳图。条纹1：标记物：116.0 kDa (-半乳糖苷酶)，66.0 kDa (牛血清白蛋白)，45.0 kDa (卵清蛋白)，29.0 kDa (碳酸酐酶)，20.1 (大豆胰蛋白酶抑制剂)与14.2 kDa (乳白蛋白)。条纹2：纯化-半乳糖苷酶蛋白用考马斯亮蓝R-250或银染色法检测图。表1. 嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的纯化-半乳糖苷酶纯化步骤总结纯化的-半乳糖苷酶的某些性质总结在表2。酶在Na
18、tive, IEF和SDS-PAGE电泳中表现出单独的蛋白带（图1）此酶是一种非糖基化的蛋白，其等电点为4.9。用葡聚糖凝胶S-300凝胶过滤和 SDS-PAGE测得的表观分子质量分别是165.9kDa、79.9kDa（图1C）。上述结果表明此酶同源酸性蛋白质，含有单独的分子形态，由两个相同分子质量的亚基组成。表2. 嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的纯化-半乳糖苷酶一些分子和生化特性 这里报告的分子质量显著小于报道的来自其他嗜热脂肪芽孢杆菌的-半乳糖苷酶，它们的分子质量范围是247到320kDa8,29,30。但是，当前菌种和其他报道的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种产的-半乳糖苷酶的亚基的分子
19、质量都在80到84kDa的范围内，暗示了所有这些菌种的基因大小相似8,28-30。纯化的-半乳糖苷酶的前10个氨基酸残基的N-末端序列是A-I-V-F-H-P-A-N-K-T。最近的序列同源性（相似度80%）是在嗜热脂肪芽孢杆菌（NUB3621）产的-半乳糖苷酶中观察到的8。在序列相似性的基础上，嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM5146）产的-半乳糖苷酶应该归类到糖基水解酶第36族。纯化的-半乳糖苷酶的二级结构用CD光谱测定。-半乳糖苷酶在50下的远紫外光谱显示pH7.0下，在222nm和208nm处负极小，在195nm附近是正带，这表明-螺旋结构占优势。温度（30-70，增量10，培养时间10分钟
20、）对蛋白质二级结构的作用和随后与用continell法则运算的CD数据（240-190nm）相关的温度分析表明，当蛋白质样品的温度从30增加到50时，大约增加了15%的板，减少了14%的无序构造（表3）。表3.-半乳糖苷酶的二级结构随温度的变化 3.2. -半乳糖苷酶的pH和温度效应 产自嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM5146）的纯化-半乳糖苷酶在5.5-8.0的pH范围内表现出最大酶活力（超过70%），并在6.5-7.0达到最佳。但是在pH5.5以下是不表现出任何活力。在中性到碱性pH范围（6.0-9.0），-半乳糖苷酶是完全稳定的，但是当在酸性缓冲液（3.5-5.5）中培养，表现出原本活力的6
21、0-80%（数据未列出）。一般地，在酵母、霉菌和植物种子中发现的-半乳糖苷酶具有较宽的最适酸碱度（在3到6之间），在酸性pH范围内也稳定。但是细菌的-半乳糖苷酶表现出较窄的最适酸碱度，在碱性pH范围内稳定5。当pNP-半乳糖苷作为底物时，-半乳糖苷酶显示的最佳温度在65，在60表现出80%相对活力，在70表现出90%相对活力。如图2所示，通过研究酶热失活相应的时间测定-半乳糖苷酶的热稳定性。研究发现，酶在50下保持完全稳定60分钟。-半乳糖苷酶在65-70下失活的半衰期分别是60-30分钟。这里的-半乳糖苷酶具有中等的热稳定性。先前报道的来自嗜热脂肪芽孢杆菌的-半乳糖苷酶，在70下的半衰期是1
22、9小时8。但是，芽孢杆菌-半乳糖苷酶的热稳定性没有热袍菌31和栖热菌酶32的高。相当数量的来自各种嗜热芽孢杆菌的-半乳糖苷酶的分子特性和热稳定性在表4中给出。数据显示，和二聚形态相比，三聚形态和四聚形态的-半乳糖苷酶具有更高的最适温度和稳定性。图2. 嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的纯化-半乳糖苷酶的温度稳定性。纯化酶样品（1.0 U/ml）在从5075的不同温度下培养。在适宜的时间间隔取出等份部分（约10l）进行残留酶活检测。获得的最高的酶活作为100%。所用符号：50（），60（），65（），70（）和75（）。表4. 产自不同嗜热芽孢杆菌菌株的-半乳糖苷酶的分子性质与热稳定性比
23、较记录水解各种苷类的活化能测定揭示了两相的或是不连续的阿仑尼乌斯图，对pNPG拐点在55，对蜜二糖、棉籽糖和水苏糖拐点在50（图3）。获得的pNPG的转变温度更高，可能是由于试验的培养时间更短。在pNPG、棉籽糖和水苏糖的情况下，表观活化能（Ea）低于转变温度时变高，高于转变温度时变低，而对蜜二糖得到了相反的数值（表6）。不连续的阿仑尼乌斯图可能是细胞膜脂类流动性随温度改变33，或是由于存在两种竞争的酶形态，每一种在不同的温度范围内居主导地位34。图3. 嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的-半乳糖苷酶对不同底物水解作用的Arrheniust图。不同底物的水解作用的反应速率常数是在不同的
24、温度（3070）下基准浓度的磷酸盐缓冲液（pH7.0）中测得的。通过每条直线部分的斜率(Ea/R)测定活化能。符号使用：pNPG（），蜜二糖（）和棉籽糖（）。3.3. 金属离子和抑制剂对-半乳糖苷酶的作用测试了-半乳糖苷酶对各种金属离子、糖和抑制剂的敏感性。与嗜热菌brokianus的-半乳糖苷酶相似32，在浓度为1mM时，酶完全被Ag+, Hg2+ 和Cu2+离子，以及硫醇改性剂PCMB抑制。同样地，这种抑制表明了在活性部位，硫醇基和/或羧基、氨基和组氨酸的咪唑基反应。其他金属离子Ba2+, Ca2+, Co2+, Fe3+, K+,Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+, Zn2+ (
25、1 mM) 和EDTA (10 mM)对酶活力没有影响，表明金属阳离子不是必要条件。测试了各种碳水化合物，半乳糖、蜜二糖和水苏糖也竞争性抑制-半乳糖苷酶的活性，半乳糖和蜜二糖的Ki值相当于16.25mM-半乳糖苷酶，水苏糖的Ki值相当于33.0mM-半乳糖苷酶。相比之下，乳糖的抑制没有竞争力，Ki值相当于14.5mM-半乳糖苷酶。其他碳水化合物，葡萄糖、果糖和蔗糖不抑制-半乳糖苷酶的活力，表明配合基约束需要D-半乳糖结构。3.4. 底物专一性和动力学研究 底物专一性和动力学研究的结果总结在表5。不同低聚半乳糖和多糖的相对水解率顺序是蜜二糖水苏糖棉籽糖槐豆胶瓜尔豆胶。低聚半乳糖的水解产物用TLC
26、分析法检测是可见的（图4），表明蜜二糖很快的水解成半乳糖和葡糖糖，而棉籽糖和水苏糖的水解相对较慢。在水苏糖水解期间，棉籽糖在反应混合液中积累，表明了速率限制阶段。嗜热芽孢杆菌（NCIM5146）的纯化的-半乳糖苷酶也能切断在二糖中的-1-3和-1-4糖苷键。实验发现-1-3糖苷键的水解率比-1-6糖苷键的水解率高。具有-1-3类型键专一性的酶在血型转换方面具有很高的实用价值，因为它能够将B型的红血球转化成普遍的供体O型血细胞。表5. 嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的-半乳糖苷酶的相对底物专一性和动力学性质图4. -半乳糖苷酶对低聚半乳糖的作用。反应液由100l 10 mM的准备在磷酸
27、盐缓冲液（50 mM， pH 7.0）的底物和10l 的酶（2.0单位）组成的。反应是在65下进行30分钟，将5l 的反应液用于TLC分析，并在上述方法培养。条纹1：标准糖混合液，条纹2：棉籽糖+酶，条纹3：水苏糖+酶，条纹4：蜜二糖+酶。T动力学研究的结果（表5）表明酶对pNPG与oNPG，相比棉籽糖、水苏糖和蜜二糖，具有更高的亲和力（低km）和水解率（高Vmax）。相似地，蜜二糖水解速率比棉籽糖快，尽管量底物都具有很相近的Km值，分别是3.92、4.0mM。此外，尽管三糖、棉籽糖、四糖和水苏糖具有相近的水解率（Vmax），但它们的Km值不同。在65下，络合pNPG、蜜二糖、棉籽糖和水苏糖的
28、结合常数分别是2000、255、250和500M-1（表6）。这表明，在不考虑底物（总链长度）的聚合程度（DP）下，糖苷（低聚糖）对酶的亲和力随着低聚半乳糖的链长每增加一个半乳糖单位而增加。通过Vant Hoff绘图法测定所有底物的络合焓值（Hb）都相近（27.0kJmol1）（表6）。合成底物，pNPG和oNPG对酶显现出较高的亲合力，可能因为其电子吸引糖苷配基35。但是，两底物，即棉籽糖和水苏糖，都表现出相似的水解率（Vmax）。pNPG与蜜二糖的催化效率（Kcat/Km）最高是因为它们的转换态最稳定（Gtb分别是-34.6和-24.6kJmol-1）。这一类关于-半乳糖苷酶的动力学和温度
29、相关性研究早先已被报道，并且Ea和Hb值已计算出36,37，尽管到目前为止，这些热力学参数和动力学参数相一致的意义并没有讨论过。表6. 不同糖苷的络合与活化的动力学与热力学参数因此和其他-半乳糖苷酶相比，当前的酶在生化和分子性质，以及底物专一性方面是异常的。简单的一步纯化步骤的产率达44.1%，促使我们对酶的结构功能关系进行推测，即用活性部位导向化学修饰和X射线晶体结构研究来研究氨基酸侧链包含的催化功能和其他可能作用，正在进行中。感谢声明非常感谢印度科学与工业研究协会（CSIR）以研究奖金的形式为M.Gote先生提供的资金援助。这些工作是作为由印度生物技术局发起的，J.M.Khire博士的重要
30、工业用酶研究项目的一部分而进行的。参考文献1 Linden JC. Immobilized -D-galactosidase in the sugar beet industry. EnzMicrobiol Technol 1982;4:1306.2 Prashanth SJ, Mulimani VH. Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae -galactosidase immobilized in calcium alginate. Process Biochem 2005;40:1199205.3 Olsson M
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