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1、-范文最新推荐- 利用冰晶核蛋白构建磷酸盐吸附蛋白大肠杆菌细胞表面展示体系 摘要：本实验克隆了来源于大肠杆菌JM109的细胞周质空间中表达的磷酸盐结合蛋白（Phosphate binding protein, PBP）编码基因phos。通过重组、转化、酶切、酶连等一系列操作，将phos基因替换重组质粒pTrcHisC-(inpN)3-gfp中的绿色荧光蛋白编码基因gfp，构建了能够展示磷酸盐吸附蛋白的3拷贝InpN串联重复大肠杆菌细胞表面展示体系。最后用磷钼酸比色法测定磷酸盐含量，从而检测构建的重组菌的磷酸盐吸附能力。从检测结果可知，构建的重组菌与对照大肠杆菌JM109相比，有显著的磷酸盐吸附
2、能力。4518关键词：磷酸盐吸附蛋白，大肠杆菌，PCR，重组菌Cell surface display of phosphate binding protein utilizing tandem repeats of ice nucleation proteinAbstract：In this study, a gene encoding phosphate binding protein (phos) which was expressed in the periplasm was cloned from Escherichia coli JM109. The recombinant pla
3、smid pTrcHisC-(inpN)3-phos was constructed by replacing gene gfp (coding the green fluorescent protein) from the recombinant plasmid pTrcHisC-(inpN)3-gfp using restriction enzyme digestion, ligation and transfomation methods. The phosphate binding protein can be displayed on the bacterial surface ut
4、ilizing tandem repeats of N-domain of ice nucleation protein. Then, phosphomolybdate colorimetry was used to determine the phosphate binding ability of recombinant strain. According to the results, compared with E. coli JM109, the recombinant strain showed high efficiency of phosphate binding abilit
5、y.Keywords: phosphate binding protein, PCR, Escherichia coli, recombinant strain目录1. 绪论.11.1磷酸盐吸附蛋白的简介11.2本课题研究方法的国内外进展11.2.1除磷的方法21.2.2生物除磷的生化机理分析 .21.2.3磷酸盐吸附蛋白在其它领域的应用3 磷酸盐吸附蛋白N末端含有25个氨基酸残基的信号肽序列，通过ABC（ATP-binding cassette）转运系统帮助PBP蛋白转运至细胞周质。成熟的PBP蛋白包含321个氨基酸残基，分子量大小约为34 kDa，缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸8。对PBP蛋白结构
6、分析表明，在80位缬氨酸处有一极为疏水的结构，这一疏水核心不含二硫键，对PBP蛋白的活性构象起稳定作用。PBP蛋白含有的四个精氨酸残基在与底物磷接触及结合作用中起重要作用13。三维结构分析表明，PBP蛋白可分为两大结构域，这两个结构域铰合在一起，中间形成疏水缺口，当磷酸盐结合到缺口处时，两结构域紧密围绕磷酸盐将其包裹其中，便于跨膜运输至细胞周质14。1.3 本课题的研究目的和意义由于大量含磷污水的排放造成了水体富营养化，因此污水流入环境之前必须通过污水处理的方法，将含磷化合物去除。污水中的磷通常以磷酸盐，聚磷酸盐和有机磷的形式存在，聚磷酸盐在酸性条件下可水解为磷酸盐，有机磷酸盐也可被水中细菌生
7、物酶作用下转化成磷酸盐，因此，磷酸盐的去除是污水除磷的关键磷是细菌细胞生长和代谢不可或缺的重要元素。磷元素的获得主要通过从环境中摄取磷酸盐等含磷物质，运输进入细胞内部，以达到为细菌细胞自身利用的目的。这一过程中涉及到磷酸盐的吸收运输调控机制以及表达的一系列相关蛋白。磷酸盐吸附蛋白不仅可作为生物传感器检测磷酸盐9。还可用于吸附水中的磷酸盐，达到净化的目的。生物除磷技术因具有节约能源、运行费用低、可减少污泥膨胀、避免二次污染的优点，而成为目前去除水体中磷的研究热点。目前许多菌属都有摄取磷酸盐等含磷物质的生物特性，但在污水处理过程中，很少有高效聚磷能力和特性稳定的工程菌得以应用。从国内外对聚磷基因的
8、研究来看，磷酸盐吸附蛋白（PBP）和磷酸盐外切酶（PPX）的基因克隆以及磷酸盐转运系统中相关蛋白是研究的热点。因此，构建高效的工程聚磷菌不仅有助于解决水体磷元素的富营养化问题，同时还将在分子水平上阐明聚磷菌的聚磷机理及其相关基因的表达调控。 pTrcHisC- 3inpN-phos设计引物phospMD-19T-phos2.2.2 培养基制备LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L ，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L ，氯化钠(NaCl) 10g/L另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.co
9、li的生长)LB固体培养基配置 （1）配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉 （2）.氨苄青霉素Amp的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55的水浴中，待培养基温度降到55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。抗生素终浓度Amp 100ug/ml，氨苄青霉素加入前已经过滤除菌。2.2.3 设计简并引物设计简并引物原则：引物长度15-40bp，引物碱基尽可能随机分布（G+C约60%），引物内部链避免二级结构，引物碱基序列不应与非扩增区域有同源性或少于连续8个的互补碱基，引物的3‘端为关键碱基 ，引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸
10、，引物与靶序列间的Tm值不应过低，引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列，两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基，引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%。根据从GeneBank上查找到磷酸盐吸附蛋白（phosphate binding protein）编码基因序列，设计用于PCR扩增phos基因引物序列： (1)模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；(2)模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性
11、成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；(3)引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。表125μL PCR反应体系反应液体系实验组（25μL体系）阴性对照组（25μL体系）ddH2O17.517.5模板DNA挑取单菌落JM1
12、090.0上游引物（10μmol/L）1.01.0下游引物（10μmol/L）1.01.010×扩增缓冲液2.52.5dNTP混合物（10mmol/L）11.0Taq酶（5U/μL）0.50.5Mg2+1.51.5总体积2525(1)将反应管放入PCR仪中，按下列条件设好程序，进行PCR反应。反应程序：94预变性5min94变性1min52退火1min30个循环 同时做两个对照:对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5&mu
13、;l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。2.2.9酶切、酶连DNA体外重组通过PCR，获得了phos基因片段，该片段两侧含有加入的2个酶切位点，通过限制性内切酶，将pMD-19T-phos基因定向重组入质粒pMB110中，然后转化表达菌株大肠杆菌JM109，构建出重组菌，重组的phos基因被置于T7启动子下游，其表达受lac操纵子调控。2.3.0 生长曲线测定将大肠杆菌JM109接种于5ml LB液体培养基中，重组大肠杆菌JM109接种于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基，37摇床上过夜培养。然后分别取0.5ml菌液于5ml相应LB液体培养基中，接种9组，接着分别
14、于培养后0，1.5，3，4，6，8，10，12，14取1ml菌液测定OD600 值。实验重复测试3次。2.3.1绘制磷酸盐标准曲线（1）准确吸取0，0.5，1，2，3，4 mL磷酸盐标准溶液(1 mL含0.1 mg PO43-)，分别加入到6支50 mL比色管中，用去离子水稀释至10 mL；（2）向各比色管中准确加入4 mL钼酸钠-硫酸溶液及1 mL 0.15%硫酸肼溶液（w/v），混匀，放入沸水浴中煮沸10 min，取出，立即流水冷却，用去离子水稀释至刻度，混匀；（3）以试剂空白为对照，在波长660 nm处进行分光光度测定。以吸光度为纵坐标，磷酸盐(以PO43-计)含量(毫克)为横坐标绘制标
15、准曲线。2.3.2用磷钼酸比色法测定重组菌磷酸盐含量（1）大肠杆菌待测菌株在50 mL无机磷培养基中，37 ºC震荡培养至对数生长期（OD600=0.60.8），IPTG诱导4 h；（2）以8000 r/min，2 min离心收集菌体，灭菌去离子水洗涤菌体，用含0.5 mg/mL PO43-的磷酸二氢钾溶液调整菌液至OD600为1.0，置于室温摇床上，每隔1 h取1 mL样品，以8000 r/min，2 min离心，取上清； 重组大肠杆菌JM109 OD600nm大肠杆菌JM109 OD600nm0.014图4重组菌和对照菌的生长曲线由图4可知，培养4h后，重组大肠杆菌和对照大肠杆菌
16、JM109的生长均处于对数生长期，8h以后基本处于稳定期，培养到14h时，两菌株的OD660均无显著差异（P0.05）。该结果表明，转入的磷酸盐吸附蛋白基因片段对于菌的生长没有造成负担.3.2磷酸盐标准曲线根据实验方法测得磷酸盐标准溶液及吸光值见表3。根据测得数据绘制标准曲线，见图5。表3磷酸盐标准溶液吸光度测定试管号123456PO43-含量mg/ml00.040.080.400.801.20OD660nm0.0030.0120.0310.1510.3010.474图5磷酸盐标准曲线3.3 磷酸盐吸附能力分析IPTG诱导重组大肠杆菌后磷酸盐吸附量及对照大肠杆菌JM109磷酸盐吸附量见表4和表5。由图6可见，在IPTG处理后，对照组大肠杆菌JM109培养液中磷酸盐浓度一直维持在较高的水平，但重组菌大肠杆菌培养液中磷酸盐浓度则显著下贱，统计学分析表明，两菌株在培养4h，培养液中磷酸盐浓度无显著差异（P0.05）；但在培养8h后，重组菌磷浓度显著低于对照组（P0.05）；培养10h后，重组菌培养液中磷酸盐浓度下降到0.39 mgmL，约为对照菌的81%。表4重组菌大肠杆菌磷酸盐吸附能力测定时间h01246810 利用冰晶核蛋白构建磷酸盐吸附蛋白大肠杆菌细胞表面展示体系(7): 15 / 16