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1、辅导教案导学诱思DAOXUEYOUSI一、PCR技术1PCR的全称是：_。2PCR技术是用于DNA片段复制、扩增的生化技术。3PCR技术用途：除用于基因扩增外，还用于_。4PCR技术的具体应用：在法学、医学、食品和考古学上也是重要的实用工具，如_鉴定、_鉴定、食品质量的确定、_病诊断、肿瘤病和其他疾病的诊断以及考古中人种的确定等。答案：1.聚合酶链反应3测定DNA序列4亲子犯罪遗传二、DNA的体内自我复制与PCR技术DNA聚合酶在有_的存在时，利用4种_，可从_末端向_末端合成新链。PCR技术还需要_作为_，这一段叫_。答案：DNA模板脱氧核苷三磷酸53与DNA模板互补的一段单链DNA聚合酶作
2、用的起点引物三、PCR作用的过程11个循环的操作：步骤具体操作双链DNA_将双链DNA加热至_，DNA_，DNA之间的_打开，双链分离(也叫做_)续表步骤具体操作与_结合双链分离后，将温度_，这一降温过程叫_。退火后，引物可与2个_分别结合DNA新链的_ _下，聚合酶可利用_组装模板的互补链，从引物延伸至_末端2.一般大约需要重复上述3步骤_个循环。3结果：一个循环形成_个双链DNA，在20个循环后(大约1h),1个DNA片段可扩增上百万个拷贝，30个循环可产生10亿个拷贝。答案：1.分开95变性氢键解链引物迅速降至4060退火单链的DNA模板延伸724种dNTP32153032四、实验操作1
3、设备、用品(略)2材料：凝胶、DNA标样、PCR试剂盒、TBE缓冲液、0.1%亚甲蓝3.步骤：文字说明：取3个0.5 mL微量离心管，分别记做1、2、3号。用取样器按表一加入试剂，关闭上盖并在振荡器上振荡20 s，使之混合均匀将3个微量离心管放在固定器上，保证每管中的液面在水浴中的水面以下。依表二的时间依次放入3个水浴进行PCR将TBE缓冲液加入到电泳槽中，使缓冲液高出凝胶面34 mm，再将样品加入凝胶板的加样孔中。所加顺序内容依次为：凝胶板中的加样情况说明表加样孔编号（对应右图所示）1234离心管中样品标号SA1A2A3所加样品1号样品20微升DNA标准溶液PCR产物1（72 1min后得到
4、的）PCR产物2（72 1min、70 2min后得到的）对照组产物2号样品2微升蓝色缓冲液1号样品与2号样品必须充分混匀后再加入开始进行电泳，若用18 V电池的电泳46 h；若甲直流电泳仪电源，80 V可电泳40 min电泳后将凝胶缓冲液倒出，缓冲液可再利用。将10 mL染色剂（亚甲蓝）覆盖在凝胶表面，1520 min后移去（可再利用），再加入5 mL70%乙醇，不断摇动12 min，使其分布均匀，再除去，加入冷水，几分钟后看到蓝色的区带出现，这就是扩增的DNA比较、判断胶片结果图表辅助：表一：试剂1号管(12个循环)2号管(14个循环)3号管(对照)PCR混合液2020蒸馏水20引物202
5、020模板DNA101010总体积505050表二：时间温度目的2 min30 s30 s1 min2 min95 95 49 72 70 开始变性(解链)最后扩增胶片染色结果核心解读HEXINJIEDU1为什么DNA复制需要引物？DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。DNA复制方向的示意图2.细胞内参
6、与DNA复制的各种组成成分和作用是怎样的？参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸3.细胞内的DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)相同吗？两者又有什么关联呢？细胞内的DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)是不同的，两者具体比较见下表：细胞内DNA复制PCR不同点解旋有解旋酶的参与，边解旋边复制80100 高度解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加温度体内温和条件高
7、温相同点 提供DNA复制的模板；四种脱氧核苷酸作原料；子链延伸的方向都是从5端到3端PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿(230)个这样的片段。4当PCR反应体系的温度经快速冷却到50左右时，为什么一般不考虑解开的2个DNA模板链又重新结合了，这是为什么？原因是：(1)模板DNA比引物长得多、复杂得多、不易重新结合；(2)引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补
8、链之间的碰撞；(3)加入的引物的量足够大而模板链数量少，模板链浓度低，不易结合。5为什么PCR能有广泛用途？除用于DNA扩增外，还有哪些用途？在生物基因组中存在着许多差异，如物种之间的差异、基因表达上的时间差异、基因表达的地域或组织差异、变异后的差异、生理和病理变化引起的差异、遗传的差异、杂交的差异等。但这些差异只有在DNA扩增后才能被观察出来。因此，PCR是这种差异的一种观察方法，因而在法医学上、在遗传病和其他疾病的诊断、考古中人种的确定、食品质量的确定上和基因转移上都可使用。6.PCR的反应过程具体是怎样的？PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性(当温度上升到90 以上时，双链
9、DNA解聚为单链)、复性(温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合)和延伸(温度上升到72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链)三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。第一轮的产物作为第二轮的模板,经过变性、复性、延伸三步第二轮的产物作为第三轮的模板,经过变性、复性、延伸三步题例领悟TILILINGWU【例题1】 一个由15N标记的DNA分子
10、，放在没有标记的环境中培养，利用PCR循环5次后标记的DNA分子占总数的()A1/10B1/5C1/16 D1/25解析：一个DNA分子利用PCR技术循环5次后产生的DNA分子数目为2n。而DNA的复制是半保留复制，其特点是新形成的DNA双链，一条是来自亲代DNA分子的母链，另一条是新形成的子链。这样最初由15N标记的DNA分子复制后，其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养，不论经过多少次复制，最初标记的两条链始终存在于两个DNA分子中，这样经过n次循环后，标记的DNA分子中的2/2n，即1/2n1。答案：CPCR技术的实质
11、就是DNA分子的复制。【例题2】 DNA的复制需要引物，其主要原因是()A可加快DNA的复制速度B引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C引物的5端有助于DNA聚合酶的延伸DNA链DDNA聚合酶只能从3端延伸DNA链解析：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从5端开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。答案：DDNA复制是有方向的，只能
12、由3端延伸至5端，而不能倒过来。随堂训练SUITANGXUNLIAN11个PCR循环后，一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，可产生几个含15N标记的DNA分子()A1个B238个C2个 D4个答案：C解析：PCR的1次循环，相当于1个DNA分子复制了1次。因为DNA的复制为半保留复制，所以形成了2个带标记的DNA分子。2DNA复制需要引物，在引物的辅助下，DNA的复制(延伸)方向是怎样的()A由3端延伸至5端B由5端延伸至3端C由3端和5端都可以延伸D由DNA分子的中间氢键处开始延伸答案：B解析：由于DNA聚合酶只能由引物的3端延伸DNA链，而DNA的两条链是反向平行的，所以引物的3端对应DNA子链的5端，所以从子链的5端向3端延伸。9用心 爱心 专心