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1、姜黄素抗顺铂肾毒性作用及其机制研究作者：张英黄维义王顺蓉陈蓉【摘要】目的探讨姜黄素抗顺铂所致大鼠肾损害的作用及其秋机制。方法选择48只雄性Wistar大鼠，随机分为，,组，蹉分别行第1次腹腔注射：生理盐水、CM卓N30mg/kg、CMN30mg/k珍g+锌原卟啉10mg/kg，8h后侗，从，组中各任选6只鼠处死，髹检测HO1蛋白表达与活力。余鼠再行第2次腹腔注射：生理盐水，CMN20浍mg/kg+顺铂6mg/kg。顺铂6mg/kg，5d后处死，检测血肌酐、尿素氮、肾脏系数、肾组织超氧化物歧化菱酶活力及谷胱甘肽和丙二醛含量。结果顺凳铂可明显升高肾组织氧化应激水平并严重并损伤肾脏的结构和功能，姜黄
2、素仅有较弱湍的直接抗顺铂肾毒性作用，但用姜黄素预谌处理上调HO1蛋白表达及活力能显著增强其抗顺铂肾毒性作用；反之，用ZnPP抑制HO1活力则可消除姜黄素抗顺铂肾毒性作用。结论姜黄素主要通过荚上调HO1蛋白表达有效拮抗顺铂所致的氧化应激性肾损伤。【关键词】顺铂；姜黄素；血红素氧合酶1；氧化应个激；肾毒性StudyonthePr涕otectiveEffectandM萃echanismofCurcumin赂onCisplatininduce骁dNephrotoxicityAb蛩stract：ObjectiveToinvestigatetheprot樯ectiveeffectsofcur垧cumin(
3、CMN)oncispla荮tininducednephrot魅oxicityinratsandthepossiblemechanism匍s.Methods48malewis汴tarratswererandoml置ydividedinto5groups：groupI(n=12),gro梧upII(n=6),groupIII骼(n=6),groupIV(n=12),groupV(n=12).RatsrecEivedintraperitoneallyinjectionf晟orthefirsttimeresp鹁ectivelywithsaline竖(groupI,groupII,gr寮oupIII),
4、CMN30mg/kg踹(groupIV),CMN30mg/kg+Zincprotoporphy镜rinIX(ZnPPIX)10mg/kg(groupV).8hoursl蜱ater，halfratsingro晶upI,groupIV,groupV凯werekilledtoanalys狭erenalHO1protEIne乍xpressandratsrecei蓐vedtheintrapariton局eallyinjectionfort凯hesecondtimerespec锸tivelywithsaline(g萦roupI),Cisplatin6mg/kg+CMN30mg/kg(gr刀oupIII)a
5、ndcisplati茕n6mg/kg(groupII,groupIV,groupV).5day纱slater,alltheanima黢lswerekilledtomeas瘌urethebloodcreatin楸in(Cr),ureanitroge耀n(BUN)andanalyseth揄erenalsuperoxidedi基smutase(SOD)activity,glulathion(GSH)腠andmalondialdehyde(MDA)contentandhis翼topathologicalcoul能dincreasetherenalo坜xidativestresslevelanddama
6、geseriouslytherenalhistology绨constructionandonl毒yhasslightdirectpr蓄otectiveeffectagai祜nstthecisplatin-in汞ducedtherenalprote皆ctiveeffectwouldin殴creasedsignificant较lybypretreatmentwithCMNtoupregulate簿renalHO1proteinle侪velandconsiderably骶attenuatedbyinhibi趾tingHO1proteinact穆ivitywithZnPP.Con悖clusionCMN
7、canprote骞ctagainstcisplatin鸵inducedoxidatives祖tressrenalinjurybyinducingHO1.Keyw璨ords：Cisplatin；Cu消rcumin；Hemeoxygen辊ase1；Oxidativest弓ress；Nephrotoxici旰ty顺铂是当前临床上最常用的抗肿瘤采药物之一，在诸如肺癌、膀胱癌、睾丸癌和卵巢癌等十余种肿瘤中被推荐为首选化棱疗药，但顺铂明显的肾毒性很大程度上限制了其在临床的应用。近年有研究报道，姜黄素能有效防止顺铂所致的急性肾损伤醅，但其作用机制尚未完全阐明1。鉴氤于顺铂主要是通过促进自由基生成致使肾跚脏遭
8、受氧化应激性损伤2，而血红素勐氧合酶1则是细胞应对各种氧化应激损参伤最重要的内源性保护因子，因此，我们濒推测CMN有可能是通过诱导HO1表达发挥抗顺铂的肾毒性作用，但迄今尚未庆见国内外有相关的研究报道。本文拟对此帧作一探讨。1材料与方法药品与试率剂顺铂为云南个旧生物药业有限公司产品旨，批号：060701。锌原卟啉及CMN购于Sigma公司。肌酐、尿素氮碍、超氧化物歧化酶及蛋白定量检测试剂盒葳购于南京建成生物工程研究所。HO1免疫组化检测抗体及试剂购于武汉博士德群公司。动物分组及处理选择健康雄性W衬istar大鼠48只，体重1852溲30g，随机分为5组：组、组，炳组、组，组。分别第1次经腹腔注
9、射瞥等容积生理盐水，CMN30mg/kg蛄，CMN30mg/kg+ZnPP10mg/kg，8h后，从，3规组中各任挑6只大鼠处死取肾检测HO沅1蛋白表达与活力。其余大鼠再分别第2娃次经腹腔注射生理盐水，CMN30mg采/kg+顺铂6mg/kg，顺铂6mg郓/kg。动物如平常自由进食摄水，5d后称重、处死，取血及肾检测各项指标。可指标检测HO1的检测采用S运ABC法检测肾组织内HO1蛋白表达厢。肾组织用10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋、切片，切片常规脱蜡、至水，羧3%H2O2灭活内源性过氧化酶，经抗荤原修复、正常血清封闭后，滴加抗及抗，DAB室温避光显色，脱水、透明、封片，显微镜下观察，见胞浆
10、有棕褐色颗钼粒者为HO1阳性表达细胞，用CD峄8病理彩色图像分析系统在200倍光镜旦下，对每张切片随机测定10个不重复视颅野的肾小管上皮细胞HO1蛋白光密度值，取平均值代表HO1蛋白表达量。烽HO1活力测定参考姚海木3的遮方法进行，即取肾组织约g，制成10%栎组织匀浆，高速离心分离微粒体，考马亮埘兰法定量蛋白浓度，再根据HO1降解芩血红素生成胆红素的原理，通过测定反应鼷体系中胆红素的生成量代表HO1活力，单位为nmol/(mg蛋白h)。血Cr，BUN及肾组织生化指标测定按邪试剂盒说明书分别采用苦味酸法、二乙酰借法测定血Cr，BUN。称双肾重量，以每100g体重对应的肾脏重量表示肾脏食系数。取肾
11、皮质约1g制成组织匀浆，按荪试剂盒说明书操作步骤测定SOD活力、哧GSH及MDA含量。组织病理学检查向取小块肾组织置于10%中性福尔马林液指中固定，常规酒精、二甲基苯脱水，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察组织擤形态学改变。统计学分析本实验所得数嫉据均为计量资料，以(s)表示，组间比较采用F+q检验，用统计软件完成。渣2结果肾组织HO1蛋白表达量妗及活力变化免疫组化分析显示，HO1黏蛋白主要表达于肾小管上皮细胞胞浆内，其中组代表基础状态，显示大鼠肾内H荬O1蛋白表达量及活力均较低。，桷组虽未检测，但因预处理方法同组，故来其HO1蛋白表达量及活力应与组相糖同。组显示CMN预处理显著上调了肾耽内
12、HO1蛋白表达量及活力。组显示卺ZnPP部分抑制了CMN诱导HO畲1蛋白的表达量并显著抑制了HO1活阂力。见图1及表1。表1HO1蛋颧白表达量及活力的比较与组比较，*遄P血和肾组织生化指标的变化与组相墀比，组单用顺铂使肾脏系数明显增加，搽血Cr，BUN明显升高，肾组织SOD吼活力及GSH含量显著下降，而MDA含颦量显著增加；组显示与顺铂同时合用C喉MN，上述指标的变化与组类似但程度研稍轻，组显示用CMN预处理，上述指咆标的变化较组显著减轻；组显示用Z储nPP+CMN预处理，上述指标的变胜化又与组相似，而较组显著。见表2葜。表2肾脏系数、血及肾组织生化指鞲标的比较与组比较，*P肾组织灞病理学变化
13、组显示肾小球及肾小管结构薷清晰，无细胞肿胀及坏死脱落。组显示鳘肾组织结构严重损伤，表现为肾小球充血缏，肾小管特别是近端小管上皮细胞明显浊咐肿，片状坏死、脱落，间质炎细胞浸润，诲管腔内有明显蛋白、细胞管型。组改变松与组类似，但程度稍轻。组病理改变潸显著减轻，肾小球及肾小管结构基本正常秀，仅皮髓交界处小管细胞轻度肿胀，偶见蝮坏死、脱落细胞，管型和炎细胞浸润均不丛明显；组则与组病变程度相似，也主仑要是肾小管严重受损，小管细胞明显肿胀森、坏死、脱落，管腔内出现大量管型等。3讨论顺铂是以2价铂为中心，同2褴个氯原子和2个氨基结合而成的重金属化合物，其亲核氨基可与水分子作用产生大疱量的自由基，造成线粒体和
14、细胞膜等氧化蛩应激性损伤。另外，顺铂还可诱导一氧化氮合酶活性升高，促进NO生成，后者既葛可与超氧化物阴离反应成大量羟自由基，诓又可使蛋白中的酪氨酸硝基化，从而抑制咧SOD活力，加重细胞损伤4。我们采用一次性注射大剂量顺铂的方式，成功诱导了急性肾损伤大鼠模型，表现为肾功熘能衰竭，肾小管上皮细胞浊肿、坏死和脱佝落等病理改变，检测肾组织内SOD活力戈及GSH含量降低而MDA含量明显升高霓，证明顺铂主要通过氧化应激的方式损伤缦肾脏，从而为顺铂肾毒性的防治确定了靶衩标。已知CMN是从植物姜黄中提取的攫天然色素，也是姜黄的主要药用成分，其置实质是一种生物多酚化合物。现代医学研绉究揭示，CMN具有直接捕捉和
15、清除自由政基的能力，其分子结构中的酚羟基在抗氧围化活性中起决定作用5。但近期发现瑛，CMN更是一个强有力的HO1诱导垅剂，CMN的抗氧化作用可能更主要依赖缔于对HO1蛋白的诱导表达6。因痍为特异性阻断HO1活性，即可显著削灬弱CMN的抗氧化能力及其细胞保护功能箧7。本研究显示，CMN与顺铂同时吨应用，其直接抗肾损伤作用较弱，但当预橛先应用CMN诱导肾小管上皮细胞内HO盐-1蛋白表达及活性升高后，则可显著抑艟制随后应用顺铂导致的肾损伤，使肾组织病理学改变及肾功能均得到极大改善，而铤用ZnPP特异性阻断HO1蛋白表爨达与活性时，CMN的上述抗顺铂肾毒性猴作用被消除，充分说明CMN抗顺铂肾毒麓性作用
16、机制主要是通过诱导HO1蛋白簪表达介导的。众多研究揭示，HO1是广泛存在于细胞微粒体内的一种可诱导的抗氧化酶，由特定的理化因素诱导表达，通过催化细胞内游离血红素降解生成重要鲨产物-胆红素与CO等，HO1/胆红唐素/CO系统具有抗氧化、抗炎、抗凋亡鞋等作用，是细胞应对氧化应激不可或缺的鼹内源性保护体系8。本文结果也显示瞅，用CMN预诱导HO1蛋白表达及活性升高后，可显著抑制顺铂引起的肾内氧蝎化应激水平，表现为脂质过氧化产物MD邶A生成减少，同时，还有效保护了细胞内负抗氧化酶SOD的活性及抗氧化物GSH赤含量，有利于维持细胞内氧化还原状态的温平衡，稳定细胞的形态与功能。而用Zn嵩PP预先阻断CMN
17、对HO1蛋白的飒诱导，特别是显著抑制HO1蛋白的活偷性，则会消除上述肾保护效果，表明CM阽N主要通过诱导HO1蛋白表达介导其鞴抗顺铂肾损伤作用。文献资料显示，CM彼N可能是通过活化Nrf2/ARE途径诱导HO1基因转录和表达的9。飙本研究结果将为临床合理应用CMN有效帝防止顺铂的肾毒性提供有力的实验依据。三【参考文献】1李昱辰，仲来福哙CMN对顺铂所致大鼠肾毒性的防护作用J.毒理学杂志，XX，20(2)：91.2王黎，裴瑞，杨红梅赅，等顺铂诱导肾损伤过程中肾皮质脂质过氧化的变化J.中国应用生理学杂狡志，XX，20(4)：393.3垃姚海木，吴学思，张靖，等血红素氧钩合酶1/一氧化碳通路参与辛伐
18、池汀抗菀高血压诱发的大鼠心肌肥厚J.生理叠学报，XX，58(2)：16.4严颖，徐兆发顺铂肾毒性防治方法的恚研究进展J.日本医学介绍，XX，莴24(8)：379.5Priy旷adarsiniKI,MaityDK诫,NaikGH,etal.Roleo上fphenolicHO1andme礁thylenehydrogenont窗hefreeradicalreact行ionsandantioxidant橐activityofcurcuminJ.FreeRadBiolMed垫,XX,35(5)：475.6谇JeongGS,OhGS,PaeHO冻,etal.Comparativee蹙ffectsofcur
19、cuminoi蒎dsonendothelialhem媸eoxygenase-1expres弥sion：orthomethoxy轩groupsareessential笫toenhancehemeoxyge鳋naseactivityandpro钒tectionJ.ExpMolM呖ed.XX,38(4)：393.嗜7ScapagniniG,Colo越mbritaC,AmadioM,et桥al.Curcuminactivat刻esdefensivegenesan丑dprotectsneuronsag千ainstoxidativestre争ssJ.AntioxidRedoxSignal.XX,8(3-4):逢395.8TakahashiT,MoritaK,AkagiR,et勒al.Hemeoxygenase-1钤:anoveltherapeutic诏targetinoxidativetissueinjuriesJ.C涟urrMedChem,XX,11(1傣2)：1545.9Balogu舞nE,HoqueM,GongP,etal.Curcuminactivat黜esthehemeoxygenase疆-1geneviaregulatio招nofNrf2andtheantio锥xidantresponsiveelementJ.BiochemJ蛭.XX,371(Pt3)：887.11/11