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1、流式细胞术的临床应用,1,流式细胞术在临床上的应用,深圳市人民医院临床医学研究中心 李富荣,流式细胞术的临床应用,2,第一部分 流式细胞仪（FCM)）工作原理,流式细胞术的临床应用,3,FCM系统结构,流体系统：样本流、鞘液 光学系统：激光光源、分光镜、滤片、 散射光和荧光探测器 分选系统：压电晶体、液流成滴、加电 系统、偏转系统 数据处理系统：计算机工作站,流式细胞术的临床应用,4,FCM工作原理流程：,样本（血液实体组织）,单细胞悬液,荧光染料特异染色的样本,上机,细胞单列通过测量区,1.散射光信号 2.荧光信号,分离、收集、分析、光信号,细胞理化特性分析图,加入荧光染料,激光激发,流式细
2、胞术的临床应用,5,流式细胞仪的构造及原理,流式细胞术的临床应用,6,FCM测量光信号获取与分析,散射光信号 前向散射光(FSC)-细胞大小 侧向散射光（SSC)-细胞粒度 （膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量） FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。 SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。,流式细胞术的临床应用,7,根据FSC-SSC二维点图，可以容易区分Lym(R3)Gran(R1)与Mono(R2),R1,R2,根据FSC-SSC二维点图，可以容易的区分出Lym(R3) .Gran(R1)与Mono(R2),流式细胞术的临床应用,8,流式细胞术常用染料及检测波长,流式细
3、胞术的临床应用,9,流式细胞术的临床应用,10,荧光染料的发射不同波长,流式细胞术的临床应用,11,DNA 和RNA荧光探针的理化特性,荧光探针 分子量 结合方式 碱基特异性 激发锋（nm) 发射锋(nm) P1 668 嵌入 无 493 630 EB 394 嵌入 无 482 616 MI 1069 非嵌入 G-C 320,445 575 CA3 1183 非嵌入 GC 320,445 575 HO33258 624 非嵌入 AT 343 480 HO33342 615 非嵌入 AT 343 455 DAPI 350 非嵌入 AT 540 650 7-AAD 1270 嵌入 GC 540 6
4、55 AO 370 嵌入 (双链） 无 492 530 静电（单链） 640 PY 303 嵌入 (双链） GCAT 549-562 565-574 静电（单链）,流式细胞术的临床应用,12,细胞周期分析,通过荧光探针对细胞周期进行相对DNA含量的测定，可分析细胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNA异倍体,流式细胞术的临床应用,13,分选系统（Sorting),依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体： 电荷式分选,稳定液流,测量区,液滴形成,液滴充电,液滴偏转,分选收集,逻辑电路,流式细胞术的临床应用,14,电荷式分选,流式细胞术的临床应用,15,通道式分选,稳定液流,测量区,逻辑
5、电路,捕获管,分选收集,流式细胞术的临床应用,16,第二部分 流式细胞术在临床医学中的应用,流式细胞术的临床应用,17,流式细胞术的临床应用,18,流式临床应用,淋巴细胞亚群分析,Th1/Th2,肿瘤学,HLA-B27,PNH,四聚体,血小板活化,细胞凋亡,移植免疫,流式细胞术的临床应用,19,流式细胞术的临床应用,20,流式细胞术的临床应用,21,流式细胞术的临床应用,22,流式细胞术的临床应用,23,流式细胞术的临床应用,24,常用淋巴细胞亚群 报告模式,流式细胞术的临床应用,25,深圳市人民医院流式细胞术报告单模式,流式细胞术的临床应用,26,流式细胞术的临床应用,27,流式细胞术的临床
6、应用,28,流式细胞术的临床应用,29,流式细胞术的临床应用,30,流式细胞术的临床应用,31,流式细胞术的临床应用,32,流式细胞术的临床应用,33,流式细胞术的临床应用,34,流式细胞术的临床应用,35,流式细胞术的临床应用,36,流式细胞术的临床应用,37,流式细胞术的临床应用,38,HLA-B27,通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，反之为阳性。,流式细胞术的临床应用,39,流式细胞术的临床应用,40,Th1/Th2细胞,流式细胞术的临床应用,41,流式细胞术的临床应用,42,流
7、式细胞术的临床应用,43,流式细胞术的临床应用,44,流式细胞术的临床应用,45,流式细胞术的临床应用,46,流式细胞术的临床应用,47,肿瘤学,流式细胞术的临床应用,48,流式细胞术的临床应用,49,流式细胞术的临床应用,50,流式细胞术的临床应用,51,流式细胞术的临床应用,52,流式细胞术的临床应用,53,流式细胞术的临床应用,54,流式细胞术的临床应用,55,流式细胞术的临床应用,56,流式细胞术的临床应用,57,流式细胞术的临床应用,58,流式细胞术的临床应用,59,流式细胞术的临床应用,60,细胞凋亡,流式细胞术的临床应用,61,流式细胞术的临床应用,62,流式细胞术的临床应用,6
8、3,流式细胞术的临床应用,64,流式细胞术的临床应用,65,流式细胞术的临床应用,66,移植免疫,流式细胞术的临床应用,67,流式细胞术的临床应用,68,流式细胞术的临床应用,69,流式细胞术的临床应用,70,流式细胞术的临床应用,71,流式细胞术的临床应用,72,四聚体,流式细胞术的临床应用,73,Tetramer-原理,内源性抗原,外源性抗原,流式细胞术的临床应用,74,Tetramer-原理,MHC Class I-HLA-A2,流式细胞术的临床应用,75,Tetramer-原理,流式细胞术的临床应用,76,Tetramer-原理,国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105
9、,流式细胞术的临床应用,77,HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽,流式细胞术的临床应用,78,抗原特异性CTL的分析方法,51Cr释放实验,PCR法,酶联免疫斑点法(ELISPOT),扩增特异T淋巴细胞受体,Tetramer法,间接法 需大量的特异性CTLs作为效应细胞 需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力 难以广泛应用,敏感性高 但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测,直接法 敏感性高 不受TCR基因型的限制,有限稀释法(LDA),用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5% 的CD8+细胞对CMV和EBV特异,流式细胞术的临床应用,79,Tetramer法,
10、Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cellsJ. Science,1998,280:227,了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命,检测病毒特异性CD8细胞的金标准(Gold Standard),流式细胞术的临床应用,80,Tetramer-应用,感染性疾病,HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSV,Breast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ova
11、rian and Leukemia,Diabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligo,EBV and CMV,移植,自身免疫性疾病,肿瘤,流式细胞术的临床应用,81,感染性疾病,Tetramer-应用-例证,含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关 慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者,用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞用Tetramer分离，富
12、集,GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败-HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果 HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力,移植,肿瘤,流式细胞术的临床应用,82,流式细胞术的临床应用,83,流式细胞术的临床应用,84,第三部分 定量流式细胞术,流式细胞术的临床应用,85,定量流式细胞术的概述,定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。 原理：通过检测标准微球的荧光强度获
13、得标准曲线，通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意义。,流式细胞术的临床应用,86,血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit,流式细胞术的临床应用,87,特点,可定量与血小板相关的任何抗原(如CD41, CD61, CD42a等) 免洗 间接法 一抗亚型为IgG1, IgG2a或IgG2b 定量范围宽(500-90,000 分子/血小板 ) 定量准确，CV值(变异系数)小,血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit,流式细胞术
14、的临床应用,88,标准曲线,血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit,流式细胞术的临床应用,89,结果,血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit,流式细胞术的临床应用,90,CD41/61复合物变形与Firbrinogen结合，为初期血栓形成的关键步骤,PLATELET Fibrinogen Kit,流式细胞术的临床应用,91,应用,心血管疾病(不稳定心绞痛，心肌梗塞等) 监测抗凝集治疗(如RepPro, Integrelin, Plavix, Ticlid等) 检测GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受体Fibrinogen结合能
15、力,血液体外(in vitro)活化(ADP等诱导)后，检测Fibrinogen结合能力 血小板活化状态(ex vivo),标本处理,PLATELET Fibrinogen Kit,流式细胞术的临床应用,92,白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit,流式细胞术的临床应用,93,特点,可定量与白细胞相关的任何抗原(如CD3, CD4, CD55, CD59等) 单个定量(用一个单抗，如CD28抗体定量白细胞表面CD28分子数) 多参数定量(如用CD8设门来定量CD8+ T细胞上CD28分子数) 全血和分离的细胞(如细胞株等)均可 间接法 一抗亚型为IgG1和I
16、gG2a 定量范围宽(1000-300,000 分子/白细胞 ) 定量准确，CV值(变异系数)小,白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit,流式细胞术的临床应用,94,标准曲线,白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit,流式细胞术的临床应用,95,结果,白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit,流式细胞术的临床应用,96,Blood Dendritic Cell Enumeration Kit,DC作用： 1.树突状细胞（dendritic cell,DC）为一群非均一性专职抗原递呈细胞，与M
17、HC二类分子结合向其它免疫活性细胞传递抗原信息。 2.骨髓样DC（MDC）和淋巴样DC(PDC).在诱导和调控免疫应答方式上完全不同：首先它们表达不同的抗原识别受体并对不同的抗原起作用；表达不同的细胞因子受体并对不同的细胞因子起反应，即使受到相同的抗原刺激。骨髓样DC（MDC）与Th1效应相关,而淋巴样DC（PDC）与Th2效应有联系； 已经应用的领域包括：1）SLE病人病情和疗效观察；2）AIDS病人免疫机能分析；3）病毒性肝炎病人免疫状况研究；4）疫苗研究。,流式细胞术的临床应用,97,特点,简便、 快捷、 绝对计数,DC亚群数/ml,流式细胞术的临床应用,98,流式细胞术的临床应用,99
18、,最新技术 计数血液中循环内皮细胞的标准方法,流式细胞术的临床应用,100,循环内皮细胞(CEC)增加于,CELLQUANT FF-CD146,急性冠状动脉综合征 血小板减少性紫癜 镰刀细胞贫血 败血症 狼疮,肾病综合征 器官移植排斥 手术创伤 癌症,传统方法,显微镜检，手工计数。费时，费力，无法标准化,流式细胞术的临床应用,101,新技术新标准,CELLQUANT FF-CD146,免疫磁珠富集与3色流式细胞术结合 仅需1 mL血 整个过程不到1个小时 灵敏度高：1mL血中可检测出10个循环内皮细胞 重复性好，室间差(Interlaboratory CV)小,流式细胞术的临床应用,102,方
19、法,CELLQUANT FF-CD146,将包被CD146单抗的铁磁性纳米颗粒(CD146FF)与1mL 血孵育 富集的CD146+细胞用以下试剂染色 PI(碘化丙啶) (确定有核细胞) CD45-FITC(排除WBC(白细胞)干扰) CD146-PE单抗(识别CD146抗原的另一位点) 标准浓度微球(用于绝对计数) 流式分析(循环内皮细胞鉴定) 有核细胞(PI+); CD45-; CD146+;前向散射角(FSC)范围宽,流式细胞术的临床应用,103,CELLQUANT FF-CD146,PI-CD45 FITC,流式细胞术的临床应用,104,CELLQUANT FF-CD146,PI-CD45 FITC,流式细胞术的临床应用,105,CELLQUANT FF-CD146,流式细胞术的临床应用,106,CELLQUANT FF-CD146,流式细胞术的临床应用,107,CELLQUANT FF-CD146,流式细胞术的临床应用,108,第四部分 在医学研究中的应用,流式细胞术的临床应用,109,优点： 1.临床医师进行疾病细胞免疫研究的一种好工具 2.可同时进行临床基础研究和疾病诊断、疗效评价 3.可与世界研究水平同步 4.临床医师不需亲自参与试验过程 5.研究工作周期短,流式细胞术的临床应用,110,