酶的生产与分离纯化瑶瑶课件.ppt

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1、酶的生产与分离纯化瑶瑶,1,酶的生产与分离纯化,酶的生产与分离纯化瑶瑶,2,酶的生产,组织提取 发酵生产 化学及生物合成,酶的生产与分离纯化瑶瑶,3,集中垄断，市场全球化： 丹麦诺和诺得公司（诺维信novozymes）美国杰能科（Genencor）、芬兰科特和丹麦丹尼斯克,国际趋势,酶的生产与分离纯化瑶瑶,4,品种、规模不断扩大,国际以液体、颗粒为主。 国内糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶三大类 重要产品系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未投入生产; 我国7家。 应用领域不断扩大 食品工业占62%,酶的生产与分离纯化瑶瑶,5,酶的发酵生产： 经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们

2、所需要酶的过程,酶的生产与分离纯化瑶瑶,6,能用于酶发酵生产的细胞需具备如下几个条件： （1）产酶量高 （2）容易培养和管理 （3）产酶稳定性好 （4）利于酶的分离纯化 （5）安全可靠,酶的生产与分离纯化瑶瑶,7,酶的发酵技术,为什么利用微生物产酶？ (1) 种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。 (2) 生长繁殖快，易提取酶. (3) 培养基来源广泛、价格便宜。 (4) 微电脑，连续化、自动化，经济效益高。 (5) 利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，,酶的生产与分离纯化瑶瑶,8,产酶微生物,产酶种类、产量、发酵条件、工艺。 主要包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。,酶的生产与分离纯化瑶

3、瑶,9,（1）枯草芽孢杆菌 细菌属 菌落粗糙，不透明 生产-淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶，碱性磷酸酶等。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,10,（2） 大肠杆菌 阴性，无芽孢 菌落光滑 用于谷氨酸脱羧酶，天门冬氨酸酶等胞内酶,酶的生产与分离纯化瑶瑶,11,（3）黑曲霉 属于真菌属 糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶等。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,12,（4） 米曲霉 糖化酶、蛋白酶,酶的生产与分离纯化瑶瑶,13,（5）根霉 主要用于糖化酶、淀粉酶、转化酶等生产,酶的生产与分离纯化瑶瑶,14,（6）毛霉 蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂肪酶等。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,15,（7）链霉菌 葡萄糖异构酶、青霉素酰化

4、酶、纤维素酶、几丁质酶等,酶的生产与分离纯化瑶瑶,16,（8）啤酒酵母 转化酶 丙酮酸脱羧酶,酶的生产与分离纯化瑶瑶,17,产酶菌株的选育 主要依据酶催化的反应性质、作用底物的特异性、底物和产物的特性以及酶在细胞中所处的位置。 胞外酶：菌落周围的透明圈、颜色变化来筛选。 胞内酶：若酶作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色变化。 而多数胞内酶产生菌的筛选：细胞破碎物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选（辅酶NAD）。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,18,选择性能优良的产酶微生物 培养基设计 选择合适的发酵方式 发酵过程的各种参数控制,酶的发酵技术,重

5、要,酶的生产与分离纯化瑶瑶,19,保藏细胞,细胞活化,细胞扩大培养,原生质体,固定化细胞,固定化原生质体,预培养,发酵,发酵,分离纯化,酶,重要,酶的生产与分离纯化瑶瑶,20,主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。,重要,培养基,酶的生产与分离纯化瑶瑶,21,（1）碳源 当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物。,重要,吃点啥？,酶的生产与分离纯化瑶瑶,22,重要,有机碳的主要来源有：一是农副产品中 二是野生的原料 以石油产品中1216碳的成分,酶的生产与分离纯化瑶瑶,23,考虑营养要求、诱导作用、分解代谢物阻遏作用。 淀粉酶生产用淀粉不用果糖,重要,酶的

6、生产与分离纯化瑶瑶,24,（2）氮源 有机氮源和无机氮源,重要,一般来说，动物细胞、植物细胞、异养型微生物、自养型微生物。 有机氮源和无机氮源配合,我有我要求,酶的生产与分离纯化瑶瑶,25,只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30% 只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低 使用高浓度有机氮源外尚需添加1%3%的无机氮源。,重要,黑曲霉酸性蛋白酶的生产,酶的生产与分离纯化瑶瑶,26,（3） 碳氮比 一般蛋白酶 (包括酸性、中性和碱性蛋白酶)低; 淀粉酶(包括淀粉酶、糖化酶、淀粉酶等) 高, 在糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,27,（4） 无机盐 常以磷酸二氢钾、

7、磷酸氢二钾等磷酸盐作为磷源，以硫酸镁为硫源和镁源。 钙 灰色链霉菌中性蛋白酶 pH77.5 pH57。,重要,酶的生产与分离纯化瑶瑶,28,钠离子 控制细胞渗透压酶产量增加，以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式，例如米曲霉淀粉酶,重要,酶的生产与分离纯化瑶瑶,29,（5）生长因子 微量的物质，或生长素。 某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶。,重要,有你才健康！,酶的生产与分离纯化瑶瑶,30,（6） 产酶促进剂 产酶促进剂 一是诱导物，二是表面活性剂。表面活性剂能增加细胞的通透性，改善氧的传递速度，保护酶的活性。,重要,酶的生产与分离纯化瑶瑶,31,发酵方式的选择 固态发酵法 液体深层发酵法,酶的生产与分离纯

8、化瑶瑶,32,(1) pH对产酶的影响 一般来说，培养基成分中碳/氮(C/N)比高，发酵液，pH低；C/N低，pH高。 添加缓冲液；调节通风量.调节培养基的初始pH；pH过高糖或淀粉来调节，pH过低氮调节。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,33,一般细菌为37 ，霉菌和放线菌为2830 ，而生产糖化酶的最适温度为3740 。,(2) 温度对产酶的影响 微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度 发酵初期 菌体繁殖旺盛时,酶的生产与分离纯化瑶瑶,34,(3)耗氧量和通风量对产酶的影响 溶解氧而定。目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物，采用自动测定和记录溶解氧的仪表。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,35,(4)

9、 搅拌的影响 有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，提高新陈代谢。打破空气气泡，使发酵液形成湍流，提高溶氧量，增加空气利用。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,36,(5) 泡沫的影响 泡沫阻碍了CO2的排除，影响溶氧量 机械消泡，消泡剂,酶的生产与分离纯化瑶瑶,37,食品用酶发酵生产实例,1、-淀粉酶的生产 生产菌种：细菌和曲霉，如枯草芽孢杆菌、黑曲霉等。 发酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体深层发酵。 回收方法：盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸附等。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,38,2、果胶酶的生产 生产菌种：真菌如曲霉菌、青霉菌，细菌如枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌。 发酵：固体曲法和液体深层发酵 回收：水提后加

10、入乙醇沉淀。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,39,酶的分离纯化,酶的生产与分离纯化瑶瑶,40,酶的纯化 特定的一种酶在细胞中的含量很少 酶可以通过测定活力加以跟踪,酶的生产与分离纯化瑶瑶,41,酶分离纯化的一般原则,1、可靠和快速的测活方法； 2、酶原料的选择； 3、酶的提取； 4、酶的提纯； 5、酶的纯度检验。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,42,酶提取分离纯化技术路线,提取,酶分离纯化,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,43,机械破碎,捣碎法 研磨法 匀浆法,物理破碎,温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂： 甲苯、

11、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween,酶促破碎,自溶法 外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,使组织、细胞的外层结构破坏,对细胞膜的作用,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，,细胞破碎方法及其原理,酶的生产与分离纯化瑶瑶,44,(1) 机械 (匀浆) 法 (2) 超声波法 处理的主要问题是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理。,生物组织的破碎,酶的生产与分离纯化瑶瑶,45,(3) 冻融法 生物组织冰冻后，胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。 加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)络合剂EDT

12、A、还原剂DTT (二硫苏糖醇)。 (4) 渗透压法 (5) 酶消化法,酶的生产与分离纯化瑶瑶,46,(6) 化学破碎法, 有机溶剂处理 表面活性剂处理 与细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,47,酶的提取,盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取,酶的生产与分离纯化瑶瑶,48,温度：一般在00C100C。 pH：在酶的稳定范围内，远离等电点pH。 缓冲液：0.15mol/L氯化钠、 0.020.05mol/L磷酸 提取液体积：一般为原料体积的1-5倍。 保护剂：底物、辅酶、某些抗氧化剂、 表面活性剂等。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,4

13、9,酶的主要提取方法,酶的生产与分离纯化瑶瑶,50,酶的分离方法,1、沉淀分离,2、离心分离,3、萃取分离,4、层析分离,Go,Go,Go,Go,5、电泳分离,Go,6、过滤与膜分离,Go,酶的生产与分离纯化瑶瑶,51,1、沉淀分离,溶解度降低从溶液中沉淀析出,酶的生产与分离纯化瑶瑶,52,介电常数降低、使酶蛋白脱水,有机溶剂法,酶的生产与分离纯化瑶瑶,53,影响有机溶剂沉 淀法分离的因素,温度 pH 离子强度 蛋白质浓度,常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、 异丙醇、甲醇等 。,选择有机溶剂的标准,必须与水完全混溶; 不与蛋白质发生反应； 要有较好的沉淀效应； 溶剂蒸汽要无毒，且不易燃

14、。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,54,阴 极,阳 极,pH=pI,pHpI,pHpI,带正电荷,带负电荷,净电荷为零,导电率,溶解度,渗透压,粘度,达到最低,等电点沉淀法,原因:在等电点时，蛋白质分子以双极离子存在，总净电荷为零, 颗粒无电荷间的排斥作用,易凝集成大颗粒，因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。,电泳分离,沉淀分离,酶的生产与分离纯化瑶瑶,55,pH=pI 溶解度最小,等电点沉淀与分离,大部或全部沉淀下来,pHpI,蛋白质的分离,沉淀出来的蛋白质可保持天然构象，能再溶解于水并具有生物活性。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,56,离心分离,离心力使不同大小、不同密度的物质分离。 颗粒大小、密度

15、和特性的不同,离心的形式： 离心沉降 离心过滤 离心分离和超离心,酶的生产与分离纯化瑶瑶,57,超速离心机,高速离心机,沉降离心机,酶的生产与分离纯化瑶瑶,58,萃取分离,利用物质在两相中的溶解度不同。两相一般互不相溶,有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取,酶的生产与分离纯化瑶瑶,59,有机溶剂萃取,常用的溶剂：醇、酮、丁醇、苯酚等。 萃取条件：00C100C。接触时间尽可能短。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,60,双水相萃取 （two-aqueous phase system extraction）,利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。,影响分配的因素： 双水相的性质、分离物质的性

16、质、 离子性质、环境因素,酶的生产与分离纯化瑶瑶,61,层析分离,利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，并以不同速度移动。,酶的生产与分离纯化瑶瑶,62,欲分离的混合溶液自柱顶加入 洗脱剂。 解吸、吸附、再解吸、再吸附,吸附层析,酶的生产与分离纯化瑶瑶,63,吸附剂与洗脱剂的选择,洗脱剂的选择 极性种类有：醇、酮、酚等。 洗脱剂的选择要注意下列各点： 洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，不会使吸附剂溶解； 洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好 纯度,酶的生产与分离纯化瑶瑶,64,离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同,阳离子交换

17、剂 阴离子交换剂,离子交换层析,酶的生产与分离纯化瑶瑶,65,凝胶过滤 分子筛层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同,凝胶层析,酶的生产与分离纯化瑶瑶,66,凝胶过滤(gel filtration chromatography),溶质分子的大小 操作方便，不会使物质变性，反复使用 凝胶层析剂的容量比较低,酶的生产与分离纯化瑶瑶,67,原理,酶的生产与分离纯化瑶瑶,68,葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶,酶的生产与分离纯化瑶瑶,69,生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力 酶与底物 酶与竞争性抑制剂 抗原与抗体 酶RNA与互补的RNA分子或片段RN

18、A与互补的DNA分子或片段,亲和层析,酶的生产与分离纯化瑶瑶,70,根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析,酶的生产与分离纯化瑶瑶,71,分配层析,利用各组分在两相中的分配系数不同 固定相、流动相 在流动相的带动流经固定相 动态分配。 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析,酶的生产与分离纯化瑶瑶,72,电泳分离,使用的支持体的不同： 薄层电泳 纸层析 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳 等电聚焦电泳,本身所带的净电荷量、颗粒形状颗粒大小、电场强度、溶液pH值、离子强度、支持体的特性,酶的生产与分离纯化瑶瑶

19、,73,过滤与膜分离,借助于过滤介质，滤纸、滤布、纤维,过滤,非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质,膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质,酶的生产与分离纯化瑶瑶,74,膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。,膜分离,加压膜分离,微滤 超滤 反渗透,电场膜分离,电渗析 离子交换膜电渗析,扩散膜分离,透析,酶的生产与分离纯化瑶瑶,75,酶分离、纯化的评价,酶的产量是以活力单位表示， 比活力、总活力,酶的生产与分离纯化瑶瑶,76,酶活力的测定 酶活力(Enzyme activity)：酶催化反应的能力，酶的含量。 1 min催化1mol底

20、物转化为产物的酶量为该酶的一个活力单位 ( 国际单位 ) ，温度为25 ，其它条件 (pH、离子强度) 采用最适条件。,重要,酶的生产与分离纯化瑶瑶,77,酶的总活力为样品的全部酶活力。 总活力 = 酶活力 总体积 (mL) 或 = 酶活力 总质量 (g),酶的生产与分离纯化瑶瑶,78,比活力 (Specific activity) ：单位蛋白质 所含有的酶活力 。酶纯度,重要,酶的生产与分离纯化瑶瑶,79,回收率 (Yield percent) ：提纯前与提纯后酶的总活力之比。酶的损失程度 提纯倍数：提纯前后两者比活力之比。,酶活力是一般采用测定产物的生成量,酶的生产与分离纯化瑶瑶,80,酶纯度的评价,电泳法 层析法 沉降法 分光光度计法 结晶法 免疫法,酶的生产与分离纯化瑶瑶,81,1、电泳法： 仅有一条区带 2、层析法：经层析后各部分比活力一致,酶的生产与分离纯化瑶瑶,82,3、免疫化学法：免疫电泳 4、超速离心沉降分析法 5、分光光度法：根据A280/A260应为的比值确定，纯酶的比值为1.75 6、结晶法,酶的生产与分离纯化瑶瑶,83,酶的保存方法, 底物、抑制剂和辅酶，不稳定状态 稳定状态。 巯基酶，加入SH保护剂。GSH、DTT Ca2+保护淀粉酶，Mn2+稳定溶菌酶，Cl稳定透明质酸酶。,