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1、实验五 免疫酶技术及其应用 ELISA 免疫酶技术及其应用-ELISA 一、实验目的 A. 了解和掌握免疫酶技术的测定原理。 B. 掌握酶联免疫吸附测定技术的操作步骤，学会利 用竞争ELISA的方法，定量测定抗体或抗原。 C. 了解免疫酶技术在生物学和医学研究的重要意义 及应用价值。 免疫酶技术及其应用-ELISA 二、实验原理 免疫标记技术（immunolabelling technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或 电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术
2、、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定 。 免疫酶技术及其应用-ELISA 免疫酶技术(enzyme immunoassay)： 是将抗原和抗体的特异性免疫反应与 酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检 测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测 相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 免疫酶技术及其应用-ELISA 酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 是一类常用的免疫酶技术。是将已知 的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使 抗原抗体反应在固相表面进行。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。 免疫酶技术及其应用-
3、ELISA ELISA检测抗原 Ag + Ab* Ag-Ab* 免疫酶技术及其应用-ELISA ELISA检测抗体 Ab + Ag* Ab-Ag* 免疫酶技术及其应用-ELISA ELISA检测抗体 Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2* 免疫酶技术及其应用-ELISA 免疫酶技术及其应用-ELISA 竞争 ELISA 检测 抗原 免疫酶技术及其应用-ELISA 固定OD值 免疫酶技术及其应用-ELISA 实验材料： 羊抗人血清白蛋白抗体（一抗） 已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线） 待检人血清白蛋白 辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗） 包被液C
4、BS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS 底物溶液：OPD-H2O2 终止液：2mol/L H2S04 酶标反应板（一条/人） 免疫酶技术及其应用-ELISA 三、操作步骤 1.包被抗原 抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标板 中，100l/孔，放入湿盒中，4过夜。 次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后 倾去），以洗去未包被的游离抗原。 抗原100ul/孔 湿盒中，4过夜 酶标板 免疫酶技术及其应用-ELISA 2.抗原与抗体的预孵育 制作标准曲线： 在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度 的抗
5、原最终为50l，分别在各抗原孔中加入250l一定浓 度的抗体，放入37恒温培养箱中30 min。 待测抗原： 取50l未知浓度的抗原按照同上操作。 待测抗原 50ul PBS 50ul 50ul 稀释液 50ul 50ul 100ul 标 准抗原 250ul抗体 稀释板 37，30 min 免疫酶技术及其应用-ELISA 3. 与固相抗原的竞争结合 取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100l，加入 酶标板的抗原孔中，放入37恒温培养箱中60 min。洗 板3次。 100ul 稀释板 酶标板 37，60 min 洗板3次 免疫酶技术及其应用-ELISA 4. 酶标二抗的结合 酶标抗体用稀释液稀释至
6、工作浓度后，加入每孔中， 100ul/孔，置湿盒中放37 30min。洗板3次。 5. 加入底物显色液（用前再配制，并置棕色瓶内） 每孔加入底物显色液，100ul/孔，湿盒中37保温一定 时间。 6. 终止反应 待出现明显颜色反应（或一定时间）后，加入终止液， 50ul/孔以终止反应。 7. 结果测定 用酶标仪在492nm波长下测定OD值。 以标准抗原的浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标绘 制标准曲线，计算未知抗原的浓度。 免疫酶技术及其应用-ELISA 四、思考题 1. 在定量测定抗原时，直接ELISA与竞争ELISA有何 区别？从理论上分析一下各自的优缺点。 2. 在实际操作中，你认为有哪些因素可以影响定量 检测的结果？（操作中应注意的问题） 3. 实验设计题：如何用竞争ELISA来定量检测抗体？ 免疫酶技术及其应用-ELISA 此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢你的支持，我们会努力做得更好！