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1、1,农药的代谢,2,代谢研究方法,活体研究in vivo 离体研究 in vitro,3,组织匀浆,沉淀（细胞核、组织碎片） 滤液,上清液 沉淀（叶绿体）,上清液 沉淀（线粒体）,上清液（胞液、核糖体 ） 沉淀（微粒体）,100,000105,000g, 1hr,9,00011,000g, 30min,1,0003,000g, 10min,过滤,4,代谢酶,初级代谢酶 水解酶、多功能氧化酶（MFO） 次级代谢酶 谷光甘肽-s-转移酶（ GST ）、葡萄糖醛酸转移酶（glucuronyl transferase）、硫酸转移酶（sulphate esterase）、甘氨酸转移酶、葡萄糖转移酶,5,
2、多功能氧化酶（MFO）,RH O2 2H ROH H2O,MFO是膜结合酶。主要由P450、NADPH-细胞色素还原酶、NADH-细胞色素b5还原酶、磷脂等成份构成。 其中细胞色素P450的还原形式与CO结合后在450 nm附近产生特征吸收峰，故命名为P450。 细胞色素P450几乎在所有的生物中都存在，包括动物、植物、昆虫、细菌等。,6,反应机理,P450本质上属于血红素硫铁蛋白（heme-thiolate protein），上面有底物和氧的结合位点。 NADPH-细胞色素还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶在酶系中起电子传递作用。,7,8,This entire reaction cycl
3、e usually takes between 1 and 10 seconds,9,P450的多样性,根据分类命名系统, P450蛋白或基因全序列同源部分40%为同一家族（family）, 用一阿拉伯数字表示； 同源性40%65%为同一亚族（subfamily）界限，在家族表达式后加一大写英文字母； 每一亚族内的单个酶则在表达式后再加一阿拉伯数字,10,哺乳动物,目前已知哺乳动物体内有14 个CYP450 家族, 即CYP1、2、3、4、5、7、8、11、19、21、24、27、51 （夏伟 ，2000）。 其中CYP1 CYP4 家族是代谢外来化合物的主要酶系, 并且各同工酶有其较固定的代
4、谢底物、反应类型。 CYP1A 的底物以环境致癌物为主, 如多环芳烃、黄曲霉毒素。 CYP2E1 则主要参与乙醇等小分子化合物的代谢, 特别是亚硝胺在体内产生致癌、诱变产物必须经CYP2E1 的A2羟化作用。 大多数临床口服药物在体内的代谢酶是CYP3A。,11,植物,植物的第一个P450cDNA 是CYP71A1 ,它是由Bozak等（1990 ）由鳄梨中分离出的与成熟有关的P450基因。 至今已鉴定了90多个植物P450 基因。它们分属于27 个家族（CYP51, CYP71, CYP72 CYP96)（刘宛等，2001）,12,昆虫,昆虫的第一个P450cDNA是Snyder和David
5、son （1983）从果蝇Drosophila mdanogaster中分离的，但当时并不知道它是细胞色素P450基因，后来被重新发现而被定名为CYP4E1。 昆虫的P450基因总数尚不清楚，至今已鉴定的昆虫P450基因已超过50个，分属6个基因家族(CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP28，CYP18)。其中CYP4，CYP6，CYP9，CYPI2，CYP28等5个基因家族为昆虫所特有（潘贻武等，2007） 。,13,P450的可诱导性,P450可以代谢许多亲脂化合物，包括胆固醇、类固醇、激素、维生素D等内源化合物和外源非极性化合物。 天然化合物 除虫菊素pyrethrins、单
6、萜类monoterpene、黄酮类flavonoid、香豆素coumarins、甾醇、异黄脑素、2十三烷酮、2十三烷酮、吲哚3甲醇、尼古丁、胡萝卜素、己醇、保幼激素、蜕皮酮、等等。 人工化合物 苯巴比妥phenobarbital(BP)、3甲基胆蒽（3MC）、DDT、环戊二烯类杀虫剂、萘napthaiene、西维因、有机磷化合物（TOCP、TPP、DEF）、丁羟基丁氧化物butylhydroxy butoxide、丁羟基甲苯butylhydroxy toluene、烷基苯alkylbenzenes、polychlorinated bephenyls（PCBs）、增效醚piperonyl but
7、oxide(PBO)、苯酰苯脲benzoylphenylureas、保幼激素类似物、等等（邱星辉、冷欣夫，1997）,14,15,根据现有资料，细胞色素P450能够被大约200种化合物诱导，能够催化约40种类型的化学反应，现有底物约1,000种（邱星辉、冷欣夫，1997）。,16,MFO参与的代谢反应,烷基羟化,芳基羟化,17,O烷基羟基化,N烷基羟基化,18,环氧化,脱S（活化）,19,S加氧（活化）,20,MFO与抗药性的关系,家蝇CYP6A1能够将艾氏剂和氯丹分别氧化为狄氏剂和环氧化氯丹 。 重组杆状病毒感染的鳞翅目细胞系统中表达的CYP6A2除了能够将艾氏剂和氯丹氧化相应的环氧化物，还
8、能通过脱硫作用和氧化酯解作用分别将有机磷杀虫剂二嗪磷diazinon代谢为diazoxon和2异丙基4甲基6羟基嘧啶。 果蝇CYP4E2基因在DDT抗性品系中高效表达 CYP6D1mRNA的高效表达与家蝇对二氯苯醚菊酯的抗性有关 （朱礼华等，2000）,21,CYP4mRNA的高效表达与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性有关 （朱昌亮等，2001）,22,MFO的检测,P450含量测定 底物氧化法 mRNA含量测定,23,P450含量测定,特征光谱：还原性P450与CO结合后在450nm处有最大吸收峰 在加有适量连二亚硫酸钠的试管里，加入微粒体悬液，混匀，通CO气体1min，在分光光度计上400500
9、nm 范围进行扫描。计算公式为P450=(A450一A490)(91Pr)1 000(nmolmg蛋白)，其中91为吸光系数，Pr为蛋白质浓度(mgmL) （严敏芬等，2006）,24,底物氧化法,7-乙氧基异吩恶唑 7-乙氧基异吩恶唑0-脱乙基酶（EROD） 7-乙氧基豆香素 7-乙氧基豆香素0-脱乙基酶（ECOD） 苯并芘BaP 芳基羟化酶(AHH) 艾氏剂 环氧化酶,25,芳香基羟基化酶（aryl hydroxylase，AHH）,刘永杰 等 （ 2005）以苯并芘为底物得抗氯氟氰菊酯的甜菜夜蛾品系中肠微粒体AHH比敏感品系高1.51倍,26,O-烷基羟基化酶,用对硝基苯甲醚，又称对硝基
10、茴香醚（p-nitroanisole, PNA）为底物。反应生成的对硝基酚在碱性条件下呈黄色，在400nm波长下比色：,27,N-烷基羟基化酶,以对氯-N-甲基苯胺为底物，每5毫升的反应体系中加入3mol。用含6%对二甲基氨基苯甲醛的3mol/L硫酸溶液中止反应，在387纳米波长下比色：,28,环氧化酶,用艾氏剂作底物，由气相色谱法检测（刘永杰 等，2005）。,29,测定MFO较为灵敏的方法，是以7-乙氧基异吩恶唑或7-乙氧基豆香素作底物，以荧光法测定酶的脱O-烷基（EROD，ECOD）活性。 测定EROD活性的反应体系中，7-乙氧基异吩恶唑的添加量只需要1mol/L, 用对硝基苯甲醚和对氯
11、-N-甲基苯胺作底物时，底物添加量分别需达到800mol/L和600mol/L。 以荧光法测定EROD活性时，取激发波长537纳米，发射波长为583纳米。,EROD,30,酶源和辅基,MFO的催化反应需要还原型辅酶II（NADPH）的参与 可直接使用NADPH，也可以用NADP、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成的NADPH生成系统作辅酶。 检测MFO的催化反应多以微粒体作为酶源,31,ethoxyresorufin,methoxyresorufin,pentoxyresorufin,32,酯酶,羧酸酯酶（B-酯酶 ，EC 3.1.1.1 ）马拉硫磷,33,芳基二烷基磷酸酯酶（A-酯
12、酶 ，EC 3.1.8.1 ，对氧磷酶 ）,34,酯酶在害虫有机磷的抗性中起着极为重要的作用，在对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯的抗性中也起一定作用。 酯酶在抗性机制中具有两个作用 通过水解作用产生无毒代谢产物 结合作用杀虫剂，形成磷酰化酶或氨基甲酰化酶，使杀虫剂不能到达靶标。 两者均能起到保护体内靶标乙酰胆碱酯酶免受抑制。,酯酶与抗药性,35,酯酶参与的代谢反应,酰胺（水解）酶乐果,36,芳基酰胺（水解）酶敌稗,37,环杨化物水解酶西维因,38,酯酶的检测,酯酶可水解-醋酸萘酯为醋酸和-萘酚。后者与固蓝B盐反应生成一个蓝紫色物质（=550600纳米nm）。 酯酶的检测也可以用-醋酸萘酯作底物，产物呈
13、紫红色。 pH对显色反应有很大影响。 染液中可加入45%的SDS，一来增色，二来终止反应。,39,-和-醋酸萘酯为非特异性底物，检测昆虫酯酶时，可在反应体系中加入10-7 mol/L左右的毒扁豆碱，以消除胆碱酯酶的活性 。 毒扁豆碱不能排除其它酯酶，如A-酯酶的活性。 所幸A-酯酶一般只存在于哺乳动物体内。,40,谷光甘肽-s-转移酶（ GST ）,根据底物的不同， GST （EC 2.5.1.18 ）又可以分为谷胱甘肽-S-烷基转移酶、谷胱甘肽-S-芳基转移酶和谷胱甘肽-S-环氧化物基转移酶。 以还原型glutathione（甘氨酸胱氨酸谷氨酸）作为辅酶 无论哺乳动物动物，还是昆虫体内的GS
14、T，多以二聚体形式存在。根据等电点的不同，可以分为碱性（）、中性（）、酸性（）三种类型,41,GST参与的代谢反应,西维因carbaryl,阿特拉津atrazine,42,GST参与的代谢反应,二嗪农diazinon,对氧磷paraoxon,43,GST的检测谷胱甘肽-S-烷基转移酶,以14C标记的碘甲烷为底物，在酶的催化下，碘甲烷与谷胱甘肽生成不挥发的衍生物，未反应的碘甲烷以溴甲醇除去，通过对标记物的测定求出酶活性：,44,GST的检测谷胱甘肽-S-芳基转移酶,以1，2-二氯-4-硝基苯（DCNB）或1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）为底物 DCNB或CDNB与还原型谷胱甘肽产生轭合物，在
15、360纳米波长下有最大吸收峰 据Fournier（1995）等的报道，家蝇体内的谷胱甘肽-S-转移酶可分为两种：酶活性的最适pH为酸性（6.5）的种类对1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）活性高，最适pH为碱性（8.0）的种类对1，2-氯-4-硝基苯有较高活性(DCNB)。,45,葡萄糖醛酸转移酶（glucuronyl transferase）,主要存在于哺乳动物体内。 辅酶：尿嘧啶核糖焦磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）,46,葡萄糖醛酸转移酶参与的代谢反应1,西维因carbaryl,47,葡萄糖醛酸转移酶参与的代谢反应2,福美铁ferbm,48,硫酸转移酶（sulphate transferas
16、e, sulfotransferase ）,存在于哺乳类、两栖类、无脊椎动物体内 辅酶：3-磷酸腺嘌呤 5-磷硫酸酯（PAPS）,3-磷酸腺嘌呤 5-磷硫酸酯（3-phosphoadenosyl 5-phosphosulphate, PAPS）,49,硫酸转移酶参与的代谢反应,50,甘氨酸转移酶,存在于植物体内 以甘氨酸作为辅酶 反应类型：,麦草畏dicamba,51,葡萄糖转移酶,存在于植物体内 以葡萄糖作为辅酶,52,葡萄糖转移酶参与的代谢反应,氯黄隆chlorsulfuron,氯黄隆在小麦、大麦中降解快，而在大豆、甜菜等敏感作物中降解慢。,53,葡萄糖转移酶参与的代谢反应,氯苯甲醚chloroneb,