酶的发酵工程课件.ppt

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1、1,第二章 酶的生物合成与发酵生产,提取分离法 微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法 生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶,2,第一节 酶生物合成及调节 一、酶的生物合成,遗传信息传递的中心法则,转录传递给RNA，再由RNA,3,（一）RNA的生物合成-转录(transcription),定义 以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。,.,4,转录模板,启动子（promotor),终止子(terminator),模板链（template strand）反意义链(antisense strand),编码链 (coding st

2、rand) 有意义链(sense strand),DNA,5,5,3,3,反意义链:指导转录作用的一条DNA链 有意义链:无转录功能的一条DNA链.,5,T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA聚合酶,有意义链,反意义链,RNA,PPi,5,5,3,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,RNA在DNA模板上的生物合成,3,3,5,6,RNA的转录过程(三步),1.起始 2.延长 3.终止,7,原核生物的RNA聚合酶(DDRP) E. coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（ 2 ）,起始因子,8,RNA合成过程

3、,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promotor),终止子(terminator),9,RNA链的延伸图解,10,定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。,（二）蛋白质的生物合成-翻译(translation),11,酪,5,5,3,AUG,GUU UAC ACA,酪氨酰- tRNA,反密码,mRNA,密码与反密码的碱基配对,12,AUG ACA,5,蛋,苏,UGU,GUU,3,受 位 (A位),给 位 (P位),大亚基,小亚基,13,蛋白质的合成过程 （大肠杆

4、菌）,氨基酸的活化 肽链合成的起始 肽链的延伸 肽链合成的终止与释放,14,氨基酸的活化与转运,反应式：,AA + tRNA + ATP,氨酰-tRNA合成酶,氨酰-tRNA+AMP+PPi,对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。,15,在核糖体上合成多肽（三阶段）,1、起始阶段 2、延伸阶段 3、终止阶段,16,肽链合成的起始阶段,1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物 2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合： 30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。 3.

5、大小亚基结合,IF1,30S起始复合物,17,AUG ACA,5,3,AUG ACA,5,3,UAC,UAC,AUG ACA,5,3,小亚基,mRNA,蛋氨酰tRNA GTP,大亚基,GDP+Pi,受位,给位,蛋,蛋,肽链合成的起始阶段,18,肽链合成的延伸阶段,1.进位:氨基酰-tRNA进入受位; 2.转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与 受位结合; 3.移位:核蛋白体向3端移动一个密码子的 位置,空出受位,不断地进位、转肽、 移位,使肽链延长。,19,AUG ACA,5,3,UAC,蛋,苏,UGU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,UGU,GUU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,U

6、GU,GUU,AUG ACA,5,蛋,苏,UGU,GUU,3,3,3,GTP GDP+Pi,GDP+Pi,GTP,起始复合体,进位,转肽,移位,Mg+ K+,20,肽链合成的终止阶段,1.出现终止密码并与终止因子结合; 2.肽键水解,多肽释放; 3.tRNA,mRNA,大小亚基解离.,21,AUG UAA,5,UAC,AUG UAA,5,UAC,3,3,终,终,AUG UAA,5,UAC,3,终,5,3,UAC,终,肽链,22,23,二、酶生物合成的调节,定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。 意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,

7、24,（一）基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）,25,基因操纵子调节系统示意图,调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 DNA 转录 （-） RNA聚合酶 （+） 转录 翻译 mRNA 翻译 阻遏蛋白 蛋白质 诱导剂,控制区 信息区,操纵子,26,调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。,27,cAMP-CRP复合

8、物的作用示意图,启动基因（promotor gene）（启动子）： 有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。,28,操纵基因（Operater gene）: 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。 结构

9、基因（Structural gene）: 决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。,29,(二) 酶合成调节的类型 1.诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。 2.阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression),30,（三）酶合成的调节机制 1. 酶合成的诱导 加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶

10、； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成； （3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。,31,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,P,LacZ,LacY,Laca,mRNA,阻遏蛋白（有活性）,启动子,O,R,A、乳糖操纵子的结构,B、乳糖酶的诱导,阻遏蛋白（有活性）,诱导,32,2.末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2

11、）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。,33,色氨酸操纵子酶的阻遏,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 结构基因表达,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 因不能表达,34,酶的诱导和阻遏操纵子模型,B.有活性阻遏蛋白加诱导剂,A.有活性阻遏蛋白,C.无活性阻遏蛋白,D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂,35,酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比,36,3.分

12、解代谢物阻遏,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,37,分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。,这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷

13、酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。,38,分解代谢物阻遏,R,LacZ,LacY,Laca,mRNA,CAP基因,结构基因,T,CAP,O,CAP结合部位,RNA聚合酶,T,cAMP -CAP,P,CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）,使CAP呈失活状态,39,三、提高酶产量的策略 （一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株 2. 基因工程

14、育种,40,（二）条件控制 1. 添加诱导物 酶的底物类似物最有效。 2. 降低阻遏物浓度 除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP,41,3.添加表面活性剂 离子型 对细胞有毒害作用 表面活性剂 Tween80 非离子型 增加细胞通透性 TritonX100 4. 添加产酶促进剂,42,第二节 酶发酵动力学 一、细胞生长动力学 在分批培养(batch culture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。,43,细胞生长曲线 O-A 延迟期 A-B指数生长期 B-C减速期

15、C-D 静止期 D-E 衰亡期,44,营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型 :比生长速率（1/h） （specific growth rate） max：最大比生长速率（1/h） S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/L Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L,45,46,二、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即： 同步合成型 生长偶联型 中期合成型 部分生长偶联型延续合成型 非生长偶联型 滞后合成型,47,1. 生长偶联型（又称同步合成型） 酶的生物合成与细胞

16、生长同步。 特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。,48,生长偶联型中的特殊形式中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。,枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线,49,2.部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。

17、,黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线,50,3. 非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。,黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线,51,总结：影响酶生物合成模式的主要因素 高：可在细胞停止生长后继 1）mRNA的稳定性 续合成酶 差：随着细胞停止生长而终 止酶的合成 2）培养基中阻遏物的存在 不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。 受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。,52,酶生产中最理想的合成模式： 延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。

18、细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于： 同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵 温度 。 滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。 中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方 面努力。,53,(二) 产酶动力学 一般产酶动力学方程可表达为：,式中 X细胞浓度(g /L) 细胞比生长速率(h-1) 生长偶联的比产酶系数(IU/g) 非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh) E酶浓度(IU/L) t时间(h),54,生长偶联型,部分生长偶联型,非生长偶联型,55,第三节 微生物发酵产酶 一、产酶微生物的分离

19、和选育 1.优良产酶菌种应具备的条件 （1）酶产量高 （2）易培养（生长速率高、营养要求低） （3）遗传性能稳定，不易退化 （4）易分离提纯 （5）安全可靠（不是致病菌）,56,2.常用的产酶微生物,57,3. 产酶微生物的分离和筛选 1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品 2)富集培养: 投其所好，取其所抗 3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。,58,-淀粉酶的筛选,59,蛋白酶产生菌的获得方法,应用含酪蛋白的培养基,60,4.产酶微生物优良菌种的选育 诱变育种 原生质体融合育

20、种 基因工程育种,61,二.微生物发酵产酶方法 1.固体培养:特别适合于霉菌培养 2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式 3.固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器,62,三.微生物酶的类型 1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。,63,酶发酵生产的一般工艺流程,64,第四节 动、植物细胞培养产酶 与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养

21、工艺。,65,动物细胞模式图,66,植物细胞结构,67,植物、动物、微生物细胞的特性比较,68,三者之间的差异主要有： 植物细胞动物细胞微生物细胞。 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,69,一、植物细胞培养产酶 1.植物细胞培养的特点 2.培养基特点 应用最广的是MS培养基和LS培养基 MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。,70,3

22、.培养方法：悬浮细胞培养 细胞株的建立；外植体与愈伤组织 扩大培养； 大罐培养；,71,外植体： 从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。 愈伤组织： 将上述外植体植入诱导培养基中，于25左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。,72,水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,73,4. 培养条件的影响与控制 （1）温度 （2）pH （3）通气与搅拌 （4）光照的控制 （5）前体的添加（饲喂） （6）诱导子（elicitors）的应用,74,5.植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为

23、例 (1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。,75,(2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux，12h/d

24、光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。,76,(3)酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。,77,二、动物细胞培养产酶 1.动物细胞培养的特点 细胞生长速度慢。（需添加抗生素） 细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 反应过程成本高，产品价格贵。 细胞具有锚地依赖性。 原代细胞一般繁殖50代。,78,2.培养基 天然培养基 合成培养基 无血清培养

25、基 无血清培养基的优点： 提高了细胞培养的可重复性，避免了血清批次之间差异的影响。 减少了由血清带来的病毒、真菌如支原体等微生物污染的危险。 供应充足稳定。 细胞产品易于优化。 避免了血清中某些因素对细胞的毒性。 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰。,79,3.培养方法 (1)悬浮培养(suspension culture) (2)贴壁培养(anchorage-dependent culture) (3)贴壁悬浮培养(pseudo-suspension culture) 微载体培养(microcarrier culture) 包埋(entrapment)和微囊(microencapsulat

26、ion)培养 结团培养(aggregate culture),80,悬浮培养 让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖的培养方法。 优点：操作简单，培养条件均一，保质供氧好，容易扩大培养规模。但对于大多数具有锚地依赖性的动物细胞，不能采用悬浮培养方式。,81,贴壁培养 让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方式。优点与悬浮培养正好相反。 缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，保质和供氧较差。,82,贴壁悬浮培养 又称假悬浮培养，将悬浮培养和贴壁培养巧妙结合的培养方法，包括： a、 微载体培养(microcarrier culture) 将葡聚糖等微小颗粒加入到培养基，动物细

27、胞可贴附在颗粒表面生长。 特点：贴附面积大，供细胞贴附生长繁殖；载体体积小，比重轻，可悬浮在培养基内。,83,b、 包埋(entrapment)和微囊(microencapsulation)培养 与微载体的不同之处：细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体内。 优点：保护细胞免受剪切力的损害；实现动物细胞高密度大规模培养；有利于下游产物纯化。 c、 结团培养(aggregate culture) 利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮法培养。 优点：操作简便，节省了用微载体的成本。,84,4.培养条件的影响与控制 （1）温度：一般控制在36.5. （2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 （3）渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 （4）溶解氧：根据情况随时调节。,85,思考题： 1. 简述转录与翻译过程。 2. 用操纵子模型解释酶的诱导与阻遏机制（末端产物、分解代谢产物） 3. 根据酶生物合成的调节类型及机制说明如何提高酶的产量。 4. 酶生物合成的模式及影响因素。 5. 优良产酶微生物菌种的获得途径及各自特点（自己整理）。 6. 比较动物植物和微生物在细胞结构、培养基和培养方式上的不同。 7. 一些概念的区别：操纵子与操纵基因 、诱导酶与组成酶、胞内酶与胞外酶、外植体与愈伤组织、初筛与复筛,