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1、本 科 毕 业 设 计（论 文）学院(部)材料与化学化工学部题 目凝血酶响应性改性表面涂层的制备及性能研究年 级2014级专业功能材料班 级功能材料班学号1409404119姓 名谭勇指导老师李丹职称副教授论文提交日期2018.05.20目录摘要1Abstract2第一章 前言41.1 生物材料表面诱导的血栓形成41.1.1材料表面诱发血栓41.1.2纤溶过程41.2 表面改性策略51.2.1 生物惰性表面51.2.2 生物活性表面61.2.3 促内皮化表面71.2.4 血栓应激性抗血栓策略81.3 课题提出91.3.1 研究目的及意义91.3.2 研究内容及方案10第二章 实验部分112.1
2、 实验材料112.1.1 试剂与药品112.1.2 实验设备122.2 实验过程122.2.1 肝素-聚赖氨酸纳米颗粒的制备与表征122.2.2 硅片表面涂覆多巴胺132.2.3 表面负载两种纳米颗粒142.2.4 混合纳米颗粒改性表面的表征142.2.5 硅改性表面的溶栓测试152.2.6 改性表面内皮细胞增殖与黏附实验15第三章 结论与分析163.1肝素-聚赖氨酸纳米颗粒（HPs）的制备及两种纳米颗粒的粒径测试163.2 纳米颗粒改性表面的表征163.2.1 纳米颗粒改性表面浸润性163.2.2凝血时间测试173.3 凝血酶响应性酶活性测试183.4 材料表面内皮化实验19结论21参考文献
3、22致谢24苏州大学本科毕业设计（论文）摘要血液接触材料，在临床医学和生物技术领域已经得到了广泛的应用，如冠状动脉支架，心脏瓣膜，血液透析器，心肺旁路系统等。异体材料的植入会不可避免地导致血栓的形成，这是血液接触装置植入失败的主要原因，因此提高生物材料的血液相容性显得极其重要。目前已经开发了一系列用于提高血液相容性的生物材料改性表面技术，包括生物惰性表面、生物活性表面和促内皮化表面。在材料表面引入具有抗凝/抗血栓活性物质是最常用的抗血栓改性策略，然而，在复杂的血液环境中，抗凝/抗血栓物质的活性往往无法有效维持，而且在正常的血液环境中持续激活抗凝/抗血栓机制，则存在导致凝血功能紊乱的潜在风险。血
4、管内皮层是已知的唯一真正意义上的抗凝血表面，但促进材料表面的内皮化往往需要较长时间。一种理想的抗血栓材料表面，应该能够在应用早期的正常血液环境中维持一定的生物惰性，抵御血液物质与表面的非特异性相互作用，而在凝血反应发生时，及时启动抗凝血/抗血栓活性功能，阻断血栓形成的途径。最后，在材料应用的过程中，表面不断形成内皮，从而满足长期应用中的血液相容性需求。为了在材料表面实现上述理想的抗血栓过程，本论文的研究内容主要是将具有血栓应激性纤溶功能的t-PA纳米胶囊和与具备抗凝血与促内皮化性质的肝素-聚赖氨酸纳米胶囊相结合，共同接枝到被多巴胺包被的材料表面上，制备基于凝血酶响应性的多功能改性表面涂层。如此
5、修饰的表面除了具备上述凝血酶响应性纤溶活性以外，在肝素组分的作用下，还能够有效延长血栓形成时间，并促进内皮细胞的粘附与生长。该涂层有望在实际应用中满足材料与血液接触不同阶段的不同抗血栓需求。关键词：抗血栓，纤溶，促内皮化，t-PA，肝素作者：谭勇指导教师：李丹 副教授AbstractBlood contact materials have been widely used in clinical medicine and biotechnology, such as coronary stents, heart valves, hemodialyzers, cardiopulmonary by
6、pass systems and so on.Implantation of foreign materials will inevitably lead to the formation of thrombus, which is the main reason for the failure of blood contact device implantation. Therefore, it is extremely important to improve the blood compatibility of biomaterials.A series of biomaterial m
7、odified surface technologies for improving blood compatibility have been developed, including bio-inert surfaces, bioactive surfaces and Endothelialized surface.The introduction of anticoagulant/antithrombotic actives on the surface of the material is the most commonly used antithrombotic modificati
8、on strategy, However, in a complex blood environment, the anticoagulant/antithrombotic activity is often not maintained effectively, and the continuous activation of anticoagulant/antithrombotic mechanisms in the normal blood environment presents the potential risk of coagulation disorders. The vasc
9、ular endothelial layer is the only truly known anticoagulant surface, but it often takes a long time to promote the endothelialization of the material surface. An ideal anti-thrombotic material surface should be able to maintain a certain degree of biological inertia in the application of early norm
10、al blood conditions to resist non-specific interactions between blood substances and surfaces. When the coagulation reaction occurs, the anticoagulant/antithrombotic activity is activated in time to block the thrombosis pathway. Finally, the endothelium is continuously formed during the application
11、of the material to meet the blood compatibility requirements in long-term applications.In order to realize the above-mentioned ideal antithrombotic process on the surface of the material, The main content of this paper is to combine t-PA nanocapsules with thrombus responsiveness and fibrinolytic fun
12、ction and heparin-polylysine nanocapsules with anticoagulant and endothelialization properties. They are co-grafted onto the surface of the dopamine-coated material to prepare a multifunctional modified surface coating based on thrombin responsiveness. The modified surface not only possesses the abo
13、ve-mentioned thrombin-responsive fibrinolytic activity, but also can effectively prolong the thrombus formation time and promote the adhesion and growth of endothelial cells under the action of the heparin component. The coating is expected to meet different anti-thrombotic requirements at different
14、 stages of contact between the material and blood in practical applications.Key words: Antithrombotic, Fibrinolysis, Endothelialization, t-PA, HeparinWritten by Yong Tan Supervised by Vice prof. Dan Li第一章 前言1.1 生物材料表面诱导的血栓形成1.1.1材料表面诱发血栓与血液直接接触的合成材料表面的凝血和血栓的形成引起了一系列严重的问题，包括人造器官、心血管系统植入体和体外血液接触医疗器械的失
15、败1。例如，血栓问题往往会导致直径小于6毫米血管接枝的堵塞2、静脉导管的封闭3以及心脏辅助器件功能的丧失4等。而且，大量实验已经证明，异体植入材料表面引发的血栓是无法完全避免的，所以，材料抗血栓改性表面一直是血液接触材料领域备受关注的课题。了解血栓，首先要了解凝血过程。即血液凝固，是流动状血液变为凝胶状血液的过程，它是止血过程中的重要部分。凝血过程指的是一系列凝血因子经过阶梯性酶促反应，生成凝血酶，最终形成纤维蛋白凝块的过程。此过程通常包括两种凝血途径：一种为内源性凝血途径，主要由接触相凝血因子XII在材料表面的吸附及激活引发；另一种为外源性凝血途径，主要由受损组织释放的因子诱发。两者的主要区
16、别在于启动方式和参与的凝血因子的不同。但这两种方式并不对立，而是相互联系的。这两种途径在凝血因子X激活后，会进入共同的凝血途径，最终导致凝血酶的生成以及纤维蛋白的形成5。凝血和抗凝是机体凝血系统的两个方面，两者保持动态平衡，使得机体的血流系统得以正常运作。抗凝系统的主要方式是体液抗凝和细胞抗凝，其中，体液抗凝是指体液中的抗凝因子对凝血因子活性的调控和抑制，包含抗凝血酶（AT）6、蛋白C系统7、肝素等。1.1.2纤溶过程此外，与凝血过程一样，纤溶也是机体的一种重要的保护性生理反应。正常的纤溶过程中涉及到纤维蛋白形成（凝血）和降解（纤溶），凝血过程是血液系统对血管损伤的生理响应，纤溶过程则是以降解
17、蛋白的方式来移除纤维蛋白，保证血管的通畅。其中，降解过程涉及到一系列蛋白质，主要包括血纤维蛋白溶酶原（Plg）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、血纤维蛋白溶酶（plasmin，pl）等。纤溶过程中的核心蛋白质是Plg，五个名为“kringle”的线圈形三级结构包含在它的结构中。其中K1和K4的内环中都存在一个赖氨酸结合位点（LBS），对于羧基端赖氨酸具有特异性亲和力8。而研究发现，在t-PA的分子结构中也具有两个kringle片段，其K2也包含LBS，同样可以和暴露在降解的纤维蛋白表面的赖氨酸残基相结合。纤溶过程的降解机理是：Plg通过与纤维蛋白的赖氨酸残基作用，与同样与纤维蛋白赖氨酸残基结
18、合的t-PA形成三元复合物。在t-PA激活剂的作用下，Plg位于Arg561-Val562处的肽键会断裂，进而转变为pl。pl裂解纤维蛋白凝块，使其暴露出更多的赖氨酸残基，进而聚集更多纤维蛋白溶酶原（Plg），加速纤溶过程9。生物血液接触材料植入机体体内时，最先引发的反应是血浆蛋白质在其表面的快速吸附10，随后所形成的蛋白质吸附层进一步诱导血小板的粘附和激活、补体激活和白细胞的反应等，最终导致血栓的形成。1.2 表面改性策略1.2.1 生物惰性表面血浆蛋白质在材料表面的吸附是血栓形成过程的最初反应。因此，可以通过在材料表面修饰生物惰性聚合物来提高材料的血液相容性。当前常用的生物惰性材料大致包含
19、两类：亲水性聚合物与两性离子聚合物。接枝亲水性聚合物的方法，相对来说比较灵活、易于调控而且不会损伤本体的机械性能，故而应用广泛。其中，最常用的亲水性聚合物是聚乙二醇（PEG）11，材料表面修饰PEG的方式主要包括物理吸附法、自组装单分子层法（SAM）12、共价接枝法（grafting to）13以及表面引发聚合（SI-grafting from）等14。此外，其它亲水性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯（PHEMA）等也被广泛应用。接枝两性离子聚合物的方法，相对于接枝亲水性聚合物来说，在生理条件下不易被氧化，抗蛋白质吸附的能力不会降低，且有更好的生物相容性15，故而也
20、被广泛关注。其中磷酰胆碱（PC）类聚合物是最早被用于材料排斥蛋白质吸附性能研究的两性离子聚合物。1.2.2 生物活性表面虽然生物惰性表面有很多优点，但是缺陷也十分明显。研究发现，在实际的生理条件下，即使它们的表面只有7 ng/cm2的纤维蛋白原（Fg）吸附也可能诱发大范围内的血小板粘附16，从而导致血栓的形成。所以进一步提出了在材料表面接枝具有特定功能的生物活性物质的方法，以期能干扰或是阻断凝血反应的进程。1.2.2.1 凝血酶抑制剂修饰表面研究发现，一些凝血酶抑制剂可以通过与凝血酶形成不可逆的复合物来抑制凝血酶的活性。常用的凝血酶抑制剂是水蛭素类抑制剂，如水蛭素、比伐卢定等。此外，一些人工合
21、成的凝血酶抑制剂如3-三氟甲基-苯磺酰-精氨酸以及阿加曲班修饰的表面均表现出凝血酶抑制活性，同时降低了血小板的粘附与激活。肝素是凝血酶类抑制剂修饰表面最常用的。肝素是由两种多糖交替连接而成的多聚体，是最常用的抗凝血药物之一。它能够通过激活血液中的抗凝血酶III（ATIII）来间接抑制如XIa，IXa，Xa以及凝血酶等凝血因子（其中Xa与凝血酶是凝血反应中最重要的因子），从而阻断凝血进程。此外，肝素还具有抗病毒、抗癌活性、调控血管生长以及抑制补体激活的功能17。所以说，材料表面肝素化是制备抗凝血材料表面应用最广泛的方法。1.2.2.2 抗血小板聚集表面由于血小板是凝血过程中主要的凝血因子，所以可
22、以通过一些血小板抑制剂来对材料表面进行改性来达到抗血栓形成的功能。其中，应用广泛的血小板抑制剂是双嘧啶莫，它可以通过灭活制磷酸二酯酶来抑制血小板的活性。Aldenhoff等将双嘧达莫共价修饰在聚氨酯表面，不仅极大降低了血小板的粘附而且有利于促进内皮细胞在表面的形成18。1.2.2.3 纤溶分子改性表面在纤溶机理的基础上，提出了一种纤溶改性表面，它使得纤维蛋白在材料表面形成时就能被立刻溶解掉。是故，为了模拟纤溶过程，首先材料表面需要具备吸附Plg的能力。其次，Plg在激活剂t-PA的作用下才能发挥功能，故需要t-PA的存在。研究发现，Plg的K1和K4的内环中各含有一个对羧基端赖氨酸具有特异性亲
23、和力的位点，称为赖氨酸结合位点（LBS），而t-PA的K2结构也含有一个LBS。所以赖氨酸修饰的表面理应可以实现纤溶过程19。1.2.3 促内皮化表面尽管前文所述的表面在溶解凝块方面十分有效，但它们在抗血栓的形成上并不十分理想。而内皮化表面是唯一已知的在各个方面与血液相容的表面20，所以表面内皮化已经被广泛应用于制作血液相容性改性表面。目前材料表面内皮化的方法主要分两类：体外接种内皮细胞和体内原位内皮化。体外接种内皮细胞是指将内皮细胞在体外扩增后种植在植入的材料表面上，但是此方法材料表面内皮细胞的覆盖率较低，而且存在生理稳定性差等问题，所以应用有限。体内原位内皮化是指将与内皮细胞相关的黏附因子
24、和生长因子等植入在材料表面上的方法。Yuan等将促内皮细胞粘附因子REDV共价固定到两性离子聚合物材料表面，将两性离子聚合物抗污性质与REDV对内皮细胞的特异性结合在一起，在排斥蛋白非特异性吸附的同时促进了内皮细胞在表面的粘附，还检测了到此表面对平滑肌细胞的抑制能力21。1.2.4 血栓应激性抗血栓策略血栓形成的过程伴随着一系列凝血因子和抗凝因子的激活，导致局部血液环境中的各项生理指标均不同于正常血液中。随着凝血系统的启动，各项凝血途径协同作用，由于最终汇入同一凝血因子凝血酶中22。凝血酶在体内的产生是一个动态过程，在血栓形成过程中局部凝血酶浓度会发生快速的改变。在体内，凝血过程涉及到细胞表面
25、性质的改变以及可溶酶原的连锁反应。在凝血初期，组织因子的激活会诱发少量凝血酶的产生，而当活化血小板表面暴露出磷脂酰丝氨酸和促凝血酶结合位点后，活化血小板会在短时间内释放出大量凝血酶，进而催化纤维蛋白原激活和聚集，形成稳定的栓块。在整个凝血系统激活的过程中，局部凝血酶的含量可以从1 nM上升到500 nM以上。因此，凝血酶含量的快速上升可以被认为是血栓形成的标志性事件之一。在凝血酶响应性体系中，作为信号因子的凝血酶可以调控体系的抗凝-溶栓功能的开启和关闭。当机体微环境中存在大量凝血酶时，体系中对凝血酶特异性响应的元件会感受信号刺激，促使体系发生相应变化，释放抗凝溶栓药物，进而开始溶解初生血栓。此
26、过程中，机体微环境中凝血酶的活性受到抑制，其含量持续减少，体系中的信号刺激也相应减弱，抗凝溶栓药物的释放量受控于体系根据上游信号强度的自动调节，直至使微环境中的凝血酶水平回到正常生理水平。体系接受到机体的这一信息反馈后，能及时关闭生物功能，停止释放抗血栓药物。随后未释放的抗血栓药物贮存在在机体中并保持安全稳定存在，并且当微环境中凝血酶水平亢进时又能重新释放，以此来为机体提供长期的、持久的、可控的抗凝保护，直至体系被完全降解。1.3 课题提出1.3.1 研究目的及意义虽然惰性抗血栓、活性抗血栓和促内皮化表面改性方面都各自有些研究进展，甚至也有些表面多功能结合的研究，但到目前为止，尚未有研究在表面
27、涂层中考虑到血栓应激性的设计。这一设计取决于对血栓微环境变化的有效利用。凝血反应过程中伴随着多种特征性凝血因子的生成，其中凝血酶作为外源性和内源性凝血途径的共同产物以及产生纤维蛋白的直接作用酶而备受关注。一些研究利用凝血酶底物多肽或凝血酶的核酸适配体所为交联剂构建药物载体，实现药物在血栓部位的定点释放。组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是负责纤维蛋白降解的纤维蛋白溶解系统的生理激活剂，被用作抗血栓形成剂。由Li等人制备了一种以t-PA为核心的纳米胶囊，使用凝血酶降解性水凝胶作为壳体，水凝胶壳层可被凝血酶降解并释放出具有完全活性的t-PA。用聚多巴胺（PDA）层作为粘合剂将t-PA NCs固定在材
28、料表面上。所得表面用防垢剂谷胱甘肽（GSH）处理，以防止与血液/血浆组分的进一步相互作用。 t-PA NCs / GSH包被的表面在正常的血浆环境中是稳定的并保持惰性，同时在凝血酶存在时释放t-PA和促进纤维蛋白溶解。而作为一种理想的抗血栓材料，在正常血液环境中应维持一定的生物惰性，阻止血液与材料表面的非特异性相互作用，当凝血反应发生时，又能及时启动抗凝血/抗血栓活性功能，阻断血栓形成。最后，在材料应用的过程中，表面不断形成内皮，从而实现材料表面的长期内皮化。受这些应用的启发，本论文将凝血酶响应性药物递送基元用于构建表面涂层，从而实现血栓应激性涂层的构建。再通过在涂层中进一步引入惰性、抗凝血和
29、促内皮化等组分，期望通过仿生血管内皮功能，使材料在实际应用中满足其与血液接触不同阶段的不同抗血栓需求。1.3.2 研究内容及方案本文主要内容为在多巴胺包被的生物材料表面上固定肝素和基于凝血酶降解组织纤溶酶原激活物（t-PA）纳米胶囊，通过肝素实现抗凝和内皮化与纳米胶囊的凝血酶响应性释放t-PA来溶解血栓。第二章 实验部分2.1 实验材料2.1.1 试剂与药品本实验所使用的主要化学及生物试剂见表1-1。实验用水都经过Millipore系统纯化，实验过程所用到的的氮气为高纯氮（99.999%）。所用到的其他常用药品溶剂均为分析纯。表1-1 实验试剂与药品药品名称及其缩写生产厂家纤维蛋白溶酶原 （P
30、lg）吉尔生化（上海）有限公司组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）Genentech, San Francisco, CAt-PA发色底物S-2288吉尔生化（上海）有限公司凝血酶Sigma-Aldrich氯化钠 (NaCl)国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠 (NaOH)国药集团化学试剂有限公司氯化钙（CaCl2）国药集团化学试剂有限公司碳酸氢钠（NaHCO3）国药集团化学试剂有限公司多巴胺盐酸盐Sigma-Aldrich聚赖氨酸上海吉尔生化有限公司磷酸二氢钠(NaH2PO4)国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠(Na2HPO4)国药集团化学试剂有限公司四甲基乙二胺（TEMED）上海生工生物工程股份
31、有限公司水蛭素Sigma-Aldrich肝素钠Biosharp实验中涉及到的相关溶液配制：（1）磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）的配制：将0.39 g磷酸二氢钠（NaH2PO4），3.33 g十二水和磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）以及8.5 g 氯化钠（NaCl）溶解于去离子水中，调节溶液pH至7.4，用1 L的容量瓶定容，于4 oC存储备用。（2）碳酸氢钠溶液的配制：将0.84 g的碳酸氢钠固体溶解于去离子水中，调节溶液pH至8.5，用1 L的容量瓶定容，配制成10 mM的碳酸氢钠溶液，于4 oC存储备用。2.1.2 实验设备 本实验所采用的主要实验仪器及其生产厂家见表1-2。表
32、1-2 本实验所用主要仪器设备仪器与材料生产厂家电子分析天平上海恒平科学仪器有限公司超纯水仪美国Millipore公司透射电子显微镜（TEM）上海索莱宝生物科技公司微量移液器Calbiochem恒温加热磁力搅拌器武汉科尔仪器设备有限公司pH计上海精密科学仪器有限公司恒温培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司多功能酶标仪赛默飞世尔科技有限公司水接触角仪美国科诺工业有限公司冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司紫外-可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司透析卡Thermo Fisher Scientific2.2 实验过程2.2.1 肝素-聚赖氨酸纳米颗粒的制备与表征2.2.1.1 肝素-聚赖氨酸纳米颗粒
33、的制备配制浓度为0.5mg/mL的聚赖氨酸溶液和7mg/mL的肝素溶液。在室温超声条件下，将浓度为7mg/mL的肝素溶液等体积逐滴加入到0.5mg/mL的聚赖氨酸溶液中，超声5min，将上述纳米颗粒溶液加入EP管中，15000rpm转速下离心15min，吸出上清液，用PBS清洗离心产物两次后加入PBS重悬，超声混匀。2.2.1.2 肝素-聚赖氨酸纳米颗粒与t-PA纳米胶囊的粒径分布测试将制备的肝素纳米颗粒溶液通过0.2 m的微孔滤膜以除去杂质颗粒，随后将样品放置于动态光散射仪中，在25 oC下进行粒径测试。每次测量重复三次。通过DigitalMicrograph 3.7软件对透射电子显微镜（T
34、EM）中的t-PA纳米胶囊尺寸进行测量并统计结果。2.2.2 硅片表面涂覆多巴胺2.2.2.1 硅片清洗将硅片浸入含有氨水和双氧水的水溶液中（去离子水/氨水/双氧水 = 5/1/1），于75 oC下浸泡10分钟，最后用大量去离子水和乙醇清洗并用氮气吹干。2.2.2.2 涂覆多巴胺用pH为8.5的10 mM Tris-HCl配制浓度为2 mg/mL的多巴胺溶液， 将硅片垂直浸没于其中，室温下静置反应6小时。用超纯水反复润洗聚多巴胺改性表面并用微小氮气流吹干。2.2.3 表面负载两种纳米颗粒将t-PA纳米胶囊与肝素纳米胶囊HPs等体积混合，将涂有多巴胺的硅片浸没到上述混合粒溶液中，室温下反应12h
35、。使用PBS清洗三次，每次10min。再用氮气吹干。2.2.4 混合纳米颗粒改性表面的表征2.2.4.1 水接触角测试表面亲水性通过测量材料表面的水接触角（WCA）进行表征，采用接触角测量仪，测量材料表面的水接触角采用悬滴法，采用/2法分析接触角，实验在室温下进行，每个样品都测试其中心部位。对于同种样品分别测量三个平行样品，最后对数据进行统计分析。2.2.4.2 凝血时间测试由于凝血过程是一系列凝血因子激活反应的复杂过程，肝素作为临床常用的抗凝剂，可以间接抑制凝血酶活性，从而延缓纤维蛋白凝块的形成速度，达到抗凝的目的，因此采用血浆复钙化方法测试肝素/聚赖氨酸纳米颗粒（HPs）改性表面的抗凝血性
36、质。其原理是在浸泡有改性材料的血浆中加入适量钙离子引发凝血，检测从钙离子加入到血浆凝固所需的时间。具体操作步骤如下：在37 oC下缓慢解冻血浆，将各样品垂直放置在96孔板中，向每孔加入150 L成人血浆（PPP），孵育到37 oC后迅速加入100 L 0.025M的氯化钙溶液，405nm下扫描，通过达到平台所需的时间来计算其血浆复钙化时间。2.2.5 硅改性表面的溶栓测试通过纤维蛋白原-凝血酶法在体外模拟血栓生成，对改性表面的凝血酶响应性纤溶活性进行测试。具体步骤如下：将改性硅表面浸没在含有纤维蛋白溶酶原（plg）的10 U/mL凝血酶溶液中降解5小时后，向上述降解液中加入100 L 纤维蛋白
37、原溶液（10 mg/mL），用多功能酶标仪监测405 nm下溶液吸光度的变化，实验在37 C下进行120分钟，每30秒读取一次吸光值。2.2.6 改性表面内皮细胞增殖与黏附实验将酒精消毒后的各样品放入48孔板中，以15000 cells/cm2的密度在其表面种植ECs，加入内皮细胞培养基，于37C 5% CO2培养箱中分别培养48 h后，样品用PBS清洗2遍，在室温条件下用4%多聚甲醛溶液对其表面的细胞固定10 min，无菌PBS清洗表面后加入0.1% Triton X-100对细胞进行破膜处理（5 min）。加入Phalloidin-FITC对细胞骨架进行染色（避光反应35 min），再加入
38、DAPI对细胞核进行染色（避光反应10 min）。利用倒置荧光显微镜观察，实验重复3次并随机挑选10张图片，每个样品表面的细胞数量利用Image-Pro软件对其进行计算。第三章 结论与分析3.1肝素-聚赖氨酸纳米颗粒（HPs）的制备及两种纳米颗粒的粒径测试通过DLS对不同投料比下制备的肝素/聚赖氨酸纳米颗粒粒径进行了测试。其结果如图3-1所示， t-PA纳米胶囊粒径主要分布在200 nm到300 nm左右。为了最大限度减小两种纳米颗粒之间的竞争吸附和相对数量难以控制的问题，我们选择粒径约与t-PA纳米胶囊一致，即粒径为300nm的肝素-聚赖氨酸纳米胶囊。 图3-1 （a）t-PA纳米胶囊（t-
39、PA NCs）粒径分布；（b）肝素-赖氨酸纳米粒子(HPs)的粒径3.2 纳米颗粒改性表面的表征3.2.1 纳米颗粒改性表面浸润性材料表面亲水性的差异直接影响着蛋白质和细胞在表面的黏附行为，进而影响材料的生物相容性。生物分子在材料表面的固定通常会引起材料表面亲疏水性的变化。本实验测试了固定纳米颗粒的一系列样品表面的水接触角，可以通过接触角的变化来反映表面亲水性的变化。测试结果如图3-2-1所示。水接触角测试结果显示，聚多巴胺在硅片表面的沉积使得材料表面水接触角有较大的增加，这主要是因为多巴胺分子中的苯环结构使其具有较强的疏水性，该表面易在血液中引发蛋白质和血细胞的黏附，不利于生物材料的使用。t
40、-PA纳米胶囊聚多巴胺表面负载后使亲水性有所提高，可能是由于纳米胶囊表面具有亲水性的丙烯酰胺基聚合物链。由于肝素和多聚赖氨酸分子中均含有大量的亲水基团，使得HPs沉积表面也具有一定亲水性。两种亲水行纳米颗粒的共混沉积使得混合纳米颗粒改性表面的水接触角有了进一步的降低。以上结果表明本工作中的纳米粒子共混表面对于提高材料生物相容性具有一定帮助。图3-2-1样品改性前后水接触角变化3.2.2凝血时间测试由于在凝血酶响应性纤溶表面的基础上引入了肝素分子，因而有望使材料达到通过抑制凝血酶活性延长凝血时间的效果。血浆复钙化时间（PRT）实验被用于在体外评价内源性凝血途径激活作用，PRT是在含有柠檬酸盐抗凝
41、血剂的血浆中加入钙离子使其形成血栓所需要的时间。当材料接触到血浆后，会激活内源性凝血途径，较长的PRT材料表面具有较好的血液相容性。如图3-2-2所示，Si-PDA-HPs表面由于肝素分子的存在，抑制了凝血因子活性，使血浆复钙化时间相较于Si-PDA表面延长了约一倍，而混合纳米颗粒改性表面Si-PDA-NCs/HPs，由于两种纳米颗粒之间不可避免的竞争作用，使得表面肝素含量略有减少，从而影响了凝血时间的延长，但改性表面相较于多巴胺表面凝血时间仍延长了20 s以上。从上述结果可以看出HPs可以成功负载于聚多巴胺层，并且表面肝素分子仍然能发挥出抗凝血活性。 图3-2-2不同改性表面的血浆复钙化时间
42、3.3 凝血酶响应性酶活性测试采用t-PA的显色底物S-2288测定Si-PDA-NCs/HPs表面在凝血酶作用下的的t-PA活性随时间的变化情况，测试结果如图3-3所示。结果显示当材料样品浸泡在含有凝血酶的血浆中时，降解液中t-PA的酶活性（溶液吸光度变化率）随着时间的推移呈线性增长。而在无凝血酶存在的条件下，5小时后表面并未表现出活性。以上结果证明该表面上的t-PA纳米胶囊可在凝血酶的作用下降解并使t-PA恢复活性，而在正常环境中保持稳定。实验也证明HPs的加入并未影响表面t-PA NCs的功能发挥。图3-3 有凝血酶存在和无凝血酶存在条件下的Si-PDA-NCs/HPs表面t-PA活性3
43、.4 材料表面内皮化实验内皮化表面是真正意义上的抗血栓表面，最接近于血管内皮层结构，因此通过促进材料表面内皮化达到抗血栓效果，已经成为目前血液接触材料表面改性研究领域的热门话题，也是解决血液接触器件引发血栓行之有效的手段。而肝素分子结构中具有多种细胞生长因子的结合位点，我们对血管内皮细胞（ECs）在肝素-聚赖氨酸纳米颗粒（HPs）改性表面上的黏附和增殖情况进行了考察。结果如图3-4-1和图3-4-2所示，由于聚多巴胺表面对细胞和蛋白均具有良好的黏附效果，因此该表面在培养48 h后，表面细胞数量较多，铺展情况良好。而t-PA纳米胶囊因具有一定的排斥蛋白质吸附作用，表面细胞黏附量较少，48 h后的
44、细胞密度较低。而肝素-聚赖氨酸纳米颗粒的引入（Si-PDA-HPs、Si-PDA-NCs/HPs）赋予了材料表面良好的促内皮化效果，两种表面在48 h后均达到了较高的细胞密度和良好的细胞铺展形态，这也说明混合纳米颗粒表面上的t-PA纳米胶囊并未对肝素分子的促内皮化功能发挥产生太大影响。图3-4-1 ECs在不同表面培养48 h后的细胞形貌图3-4-2 ECs在不同表面培养48 h后的细胞密度结论血液接触材料表面引入生物活性分子抗血栓是近年来的热点问题，而且单功能改性表面已经逐渐转向多功能改性表面的研究。本文将凝血酶响应性t-PA纳米胶囊与肝素-聚赖氨酸纳米颗粒（HPs）结合，分别测定了两种纳米
45、颗粒的粒径分布，结果表面表明通过调节制备条件，可以得到两种粒径相似的纳米颗粒并将其负载于聚多巴胺表面。首先，水接触角测试证明了两种纳米颗粒在硅片表面的成功修饰。酶活性测试结果显示表面t-PA纳米胶囊具有凝血酶响应性酶活性。最后，凝血时间测试，材料表面内皮化实验以及凝血酶响应性酶活性测试表明了两种生物活性分子的引入，并没有干扰彼此执行各自的功能。综上所诉，本文提出的凝血酶响应性多功能改性表面涂层兼有纤溶，抗凝和促内皮化的特性，并且通过连续固定的策略避免了生物分子间的竞争和相对数量不可控制的问题。参考文献【1】M. B. Gorbet, M. V. Sefton, Biomaterials 200
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